专利名称：快速检测尿液中大肠杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测尿液中大肠杆菌的方法。
技术背景目前人们检测和定量大肠杆菌主要是通过传统的细菌培养法，但此法鉴定细菌并对其细 菌的数量进行定量需要2 3天的时间，不利于因大肠杆菌感染而引起的尿路感染等疾病的 早期诊断与治疗。对于尿液中的大肠杆菌进行检测和鉴定的方法中，也会用到PCR或是实时 定量PCR，但这些方法的特异性和敏感性较差，且价格昂贵，不利于闩常工作的开展。为节 省检测时间。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足和存在的问题，进而提供一种快速检测尿液中大 肠杆菌的方法，本发明的特异性和敏感性均较好，能快速检测和鉴定尿液中的大肠杆菌。本发明提供的技术方案是快速检测尿液中大肠杆菌的方法，用无菌尿杯收集尿液，然后从中取尿液1.0 2. 0ml于EP管，2000 3500 rpm离心2 4 min，取上清400 1200 "1 转至另一EP管，10000 15000 rpm离心至少5 min，弃上清，吸取100 200 y 1尿沉渣涂 片2张，固定后， 一张玻片上加入浓度为2 10 ng/ul的探针30 50 y 1，另一张玻片上 加入浓度为1 ng/ul的探针，然后在45" 55'C条件下避光杂交30 45 min，清洗后，置 于洗涤液中浸泡10 20 min，清洗，干燥后，置荧光显微镜下观察结果。上述杂交温度优选为5(TC,杂交时间优选为35 min，杂交在湿盒中进行。上述固定可采用火焰固定法或酒精固定法。所述探针已用荧光素标记，其中一探针用杂交缓冲液稀释成2 10 ng/ul的浓度，另 一探针用杂交缓冲液稀释成1 ng/ul的浓度；其中杂交缓冲液的成分为20 mmol/L Tris-HCl、 0. 9隱ol/L. NaCl、 20%甲酰胺(formamide)和0. 1%十二烷基硫酸钠(SDS)， pH 7. 2。上述洗涤液的成分为20画1/L Tris-HCl， 180 mmol线Cl, pH7. 2。本发明的优点在于(1) 敏感本发明所采用的方法十分敏感，最低检出限达到了 103 104CFU/ml。(2) 特异本发明所采用的方法特异性强，特异性进达到100%.其理论基础主要是基于成熟的细菌遗传学原理。(3)快速 一份临床标本的检测时间约为1 h，耗时较传统培养鉴定方法大为縮短。
图1为本发明探针浓度为2 10 ng/y 1的FISH图像； 图2为本发明浓度为1 ng/ul的FISH图像。
具体实施方式
下面通过实例进一步叙述本发明。在下述实例中，探针用荧光素FITC标记，固定方法是用的96%的乙醇固定，其操作方法 如下实例1:1. 样本的准备及预处理吸取尿液O. 5 ml于EP管，2000 rpm离心4 min,取上清400 u 1 转至另一EP管，10000 rpm离心20min，弃上清，吸取100 U 1尿沉渣涂片2张。2. 杂交片制备将玻片浸入固定液中固定10 min，取出室温晾干备用；3. 杂交在一张玻片上加入浓度为2ng/ul的探针(所述探针已用荧光素标记，且用杂交 缓冲液稀释成2ng/"l的浓度，其中杂交缓冲液的成分为20 mmol/L Tris-HC1、 0.9 隱ol/L.NaCl、 20%甲酰胺和0. 1%十二垸基硫酸钠，pH 7.2) 30ul，另一张玻片上加入 浓度为1 ng/u 1的探针(所述探针已用荧光素标记，且用杂交缓冲液稀释成lng/u 1的 浓度，其中杂交缓冲液的成分为20醒ol/L Tris-HC1、 0.9誦ol/L.NaCl、 20%甲酰胺 和0. 1%十二烷基硫酸钠，pH 7.2)30ul，然后同时在40。C条件下避光杂交30 min,杂 交过程在湿盒中避光进行。4. 洗涤将杂交片浸泡在洗涤液(洗涤液成分为20 mraol/L Tris-HC1， 180 mmol/LNaCl， pH7.2)中10 min，以除去未结合探针，室温晾干。5. 封片向杂交片上滴加一滴磷酸盐缓冲液(PBS)，盖上盖玻片，在荧光显像下观察是否 存在发光(与探针对应的荧光)的细菌；6. 结果分析在使用lng/y l浓度的探针时，在荧光显微镜下均能见到大肠杆菌典型的杆 状结构，且呈现出FITC特异的绿色荧光信号(如图2)，在使用2ng/ul浓度的探针时， 也能在荧光显微镜下均能见到大肠杆菌典型的杆状结构，且呈现出FITC特异的绿色荧光 信号(如图1)。实例21. 样本的准备及预处理吸取尿液0.8 ml于EP管，3000 rpm离心3 min，取上清600 u 1 转至另一EP管，13000 rpm离心15min，弃上清，吸取150 U 1尿沉渣涂片2张。2. 杂交片制备将玻片浸入固定液中固定15 niin，取出室温晾干备用；3. 杂交在一张玻片上加入浓度为5 ng/ul的探针(所述探针已用荧光素标记，且用杂交缓冲液稀释成5ng/y 1的浓度，其中杂交缓冲液的成分为20mmol/LTris-HCl、 0.9 mmol/L.NaCl、 20%甲酰胺和0. 1%十二烷基硫酸钠，pH 7.2) 40 u 1，另一张玻片上加入 浓度为1 ng/u 1的探针(所述探针已用荧光素标记，且用杂交缓冲液稀释成lng/iU的 浓度，其中杂交缓冲液的成分为20 mmol/L Tris-HCl、 0.9 mmol/L. NaCl、 20%甲酰胺 和0. 1%十二烷基硫酸钠，pH 7.2) 40 ul，然后同时在50'C条件下在湿盒中避光杂交 35 min;4. 洗涤将杂交片浸泡在洗涤缓冲液中15 min，以除去未结合探针，室温晾干；5. 封片向杂交片上滴加一滴PBS，盖上盖玻片，在荧光显像下观察是否存在发光(与探 针对应的荧光)的细菌；6. 结果分析结果分析在使用lng/ul浓度的探针时，在荧光显微镜下均能见到大肠杆 菌典型的杆状结构，且呈现出FITC特异的绿色荧光信号(如图2)，在使用5ng/yl浓 度的探针时，也能在荧光显微镜下均能见到大肠杆菌典型的杆状结构，且呈现出FITC特 异的绿色荧光信号(如图1)。实例31. 样本的准备及预处理吸取尿液1.5 ml于EP管，3500 rpm离心2 min，取上清1. 2 ml 转至另一EP管，15000 rpm离心10min，弃上清，吸取200 U 1尿沉渣涂片2张。2. 杂交片制备将玻片浸入固定液中固定20 min，取出室温晾干备用；3. 杂交在一张玻片上加入浓度为10 ng/ul的探针，另一张玻片上加入浓度为l ng/ul 的探针各50 ul，然后同时在玻片上加入探针50 yl，在55'C条件下在湿盒中避光杂交 45 min。4. 洗涤将杂交片浸泡在洗涤缓冲液中20 min，以除去未结合探针，室温晾干。5. 封片向杂交片上滴加一滴PBS，盖上盖玻片，在荧光显像下观察是否存在发光(与探针 对应的荧光)的细菌；6. 结果分析结果分析在使用1 ng/ul浓度的探针时，在荧光显微镜下均能见到大肠杆 菌典型的杆状结构，且呈现出FITC特异的绿色荧光信号(如图2)，在使用10ng/ul浓 度的探针时，也能在荧光显微镜下均能见到大肠杆菌典型的杆状结构，且呈现出FITC特 异的绿色荧光信号(如图1)。
权利要求
1. 快速检测尿液中大肠杆菌的方法，其特征在于用无菌尿杯收集尿液，然后从中取尿液1.0～2.0ml于EP管，2000～3500rpm离心2～4min，取上清400～800μl转至另一EP管，10000～15000rpm离心至少5min，弃上清，吸取100～200μl尿沉渣涂片2张，固定后，一张玻片上加入浓度为2～10ng/μl的探针30～50μl，另一张玻片上加入浓度为1ng/μl的探针，然后在45℃～55℃条件下避光杂交30～45min，清洗后，置于洗涤液中浸泡10～20min，清洗，干燥后，置荧光显微镜下观察结果。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于杂交在湿盒中进行，杂交温度为50'C，杂交 时间为35 min。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于固定采用火焰固定法或酒精固定法。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述探针已用荧光素标记，其中一探针 用杂交缓冲液稀释成2 10 ng/u 1的浓度，另一探针用杂交缓冲液稀释成1 ng/u 1的 浓度；其中杂交缓冲液的成分为20 mmol/L Tris-HCl、 0.9鹏ol/L.NaCl、 20%甲酰胺 和0. 1%十二烷基硫酸钠，pH 7. 2。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于洗涤液的成分为20隱ol/LTris-HC1， 180 mmol/LNaCl， pH7.2。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测尿液中大肠杆菌的方法用无菌尿杯收集尿液，然后从中取尿液1.0～2.0ml于EP管，2000～3500rpm离心2～4min，取上清400～800μl转至另一EP管，10000～15000rpm离心至少5min，弃上清，吸取100～200μl尿沉渣涂片2张，固定后，一张玻片上加入浓度为2～10ng/μl的探针30～50μl，另一张玻片上加入浓度为1ng/μl的探针，然后在45℃～55℃条件下避光杂交30～45min，清洗后，置于洗涤液中浸泡10～20min，清洗，干燥后，置荧光显微镜下观察结果。本发明所采用的方法十分敏感，最低检出限达到了10<sup>3</sup>～10<sup>4</sup>CFU/ml。本发明所采用的方法特异性强，特异性进达到100％。其理论基础主要是基于成熟的细菌遗传学原理。本发明一份临床标本的检测时间约为1h，耗时较传统培养鉴定方法大为缩短。
文档编号C12Q1/04GK101275159SQ20081004759
公开日2008年10月1日 申请日期2008年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者艳 李, 潘小平, 明 王 申请人:武汉大学