专利名称：四种致腹泻性大肠杆菌的多重pcr检测方法及其引物组的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及ー种基于多重PCR技术快速检测四种致腹泻性大肠杆菌的方法及其专用引物。
背景技术：
食品安全是全球性的重大公共卫生问题，已报道的食源性疾病致病因子有250多种，其中肠道致病菌是食源性疾病中最常见的生物致病因素。据世界卫生组织(WHO)报道，全球毎年因食源性微生物污染引起的腹泻病例达数亿起，死亡的(Γ15岁儿童约170万人。目前致腹泻性大肠杆菌仍是引起腹泻的重要病原之一，特别是婴幼儿腹泻，在我国及国外腹泻患者中致腹泻性大肠杆菌检出率、构成比、优势类型及血清型不同，给临床诊断带来不便。
大肠埃希菌{Escherichiacoli, Ε· coif)俗称大肠杆菌，由 Escherich 于 1885年首次发现，起初一直被认为是肠道菌群的正常组成部分，属于条件致病菌。20世纪中叶，人们认识到某些特殊血清型大肠杆菌对人和动物有致病性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致腹泻性大肠杆菌(diarrheogenicE. cWi)，根据生物学特性主要分为四类产肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC)。致腹泻性大肠杆菌作为人畜共患性致病菌，具有重要的公共卫生意义。ETEC主要感染儿童和旅游者，发展中国家尤为严重，被污染的水和食物是主要传染来源，主要致病因素是大肠杆菌肠毒素LT或ST，感染的临床症状轻度时为温和性腹泻，严重时可发展为霍乱样腹泻症状；EPEC是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可致死，病原菌主要感染肠上皮细胞或组织培养细胞表面形成特征性的组织病理学损伤；EIEC主要引起大龄儿童和成年人腹泻，曾爆发流行，临床症状为水样腹泻，有时呈现痢疾症状；EHEC主要血清型是0157:H7，引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺毒素样细胞毒素。目前我国针对致腹泻性大肠杆菌的检测方法主要以传统检测方法为主，具体操作流程为待检样品一增菌一分离培养一革兰染色镜检/生化及菌落观察/生化反应试验/肠毒素检查等，操作复杂繁琐，检测时间长，完成整个检测程序需要5 10d，且检测目标单一。在此情况下，采用多重PCR方法一次性检测出単一病原感染或混合感染，对保障食品安全和人类健康具有现实意义。本发明根据选取的4种致腹泻性大肠杆菌靶基因序列的保守区设计合成了 4对特异性PCR引物，通过体系及反应条件优化，建立了ー步反应同时检测4种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR方法。实践证实，本发明方法比常规的细菌分离鉴定敏感度高且检测快速，可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种具有快速、准确、灵敏、特异的一歩反应同时检测肠出血性大肠杆菌0157:H7、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和肠毒素性大肠杆菌4种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR方法。本发明的目的是这样实现的分别选择肠出血性大肠杆菌0157:H7 O-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌LT基因、肠致病性大肠杆菌/基因和肠侵袭性大肠杆菌invasionplasmid基 因为靶基因，通过基因序列的比对分析，选取靶基因序列的保守区设计合成引物，建立多重PCR检测方法，对4种致腹泻性大肠杆菌进行定性检测。一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测引物组，核苷酸序列为
肠出血性大肠杆菌O157 = H7引物对为
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
肠毒素性大肠杆菌引物对为
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
肠致病性大肠杆菌引物对为
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
肠侵袭性大肠杆菌引物对为
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。本发明还具有如下特征
I、所述的引物对的添加摩尔比为OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR为I: I: I: I. 3。2、一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测用阳性对照品的制备PCR扩增引物组，核苷酸序列为
肠出血性大肠杆菌O157 = H7阳性对照品的制备PCR扩增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
肠毒素性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
肠致病性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
肠侵袭性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。3、一种非诊断或治疗目的的四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测方法，包括如下步骤
(I)PCR模板的制备
參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化；(2)设计PCR引物
选择肠出血性大肠杆菌O157 = H7的Ο-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌的LT基因、肠致病性大肠杆菌的^基因和肠侵袭性大肠杆菌的invasion plasmid基因作为祀基因，设计合成以下引物进行靶基因的扩增
肠出血性大肠杆菌O157 = H7 Ο-antigen基因的PCR扩增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
肠毒素性大肠杆菌LT基因的PCR扩增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
肠致病性大肠杆菌/基因的PCR扩增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
肠侵袭性大肠杆菌invasion plasmid基因的PCR扩增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'；
利用设计合成的靶基因PCR引物，分别以肠出血性大肠杆菌O157 = H7 (ATCC 35150)、肠毒素性大肠杆菌(ATCC 35401)、肠致病性大肠杆菌(ATCC 11775)和肠侵袭性大肠杆菌(ATCC 43893)的基因组DNA为模板扩增靶基因，将扩增的靶基因序列进行BLAST比对分析，分别选取每种致腹泻性大肠杆菌靶基因序列的保守区设计合成了 4对特异性多重PCR鉴定引物
肠出血性大肠杆菌O157 = H7
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
肠毒素性大肠杆菌
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
肠致病性大肠杆菌
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
肠侵袭性大肠杆菌
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3;；
(3)阳性质控标准品的制备
采用PCR法分别扩增肠出血性大肠杆菌0157:H7 Ο-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌LT基因、肠致病性大肠杆菌ΑφΑ基因和肠侵袭性大肠杆菌invasion plasmid基因，分别将PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，參照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒；
(4)PCR反应体系经过对不同组合实验结果的比较分析，确定了最佳的单重PCR反应体系及反应条件，相应的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图I。单重PCR反应体系，如下表
权利要求
1.一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测用引物组，其特征在于，核苷酸序列为 肠出血性大肠杆菌O157 = H7引物对为OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3', OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 肠毒素性大肠杆菌引物对为LF :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3', LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 肠致病性大肠杆菌引物对为BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'， BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 肠侵袭性大肠杆菌引物对为IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。
2.根据权利要求I所述的一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测用引物组，其特征在于所述的引物对的添加摩尔比为OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR为I: I: I: I. 3。
3.一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测用阳性对照品的制备PCR扩增引物组，其特征在于，核苷酸序列为 肠出血性大肠杆菌O157 = H7阳性对照品的制备PCR扩增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3', EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 肠毒素性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'， ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 肠致病性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3', EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 肠侵袭性大肠杆菌阳性对照品的制备PCR扩增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'， EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。
4.一种非诊断或治疗目的的四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)PCR模板的制备 参照天根TIANamp Bacteria DNA Kit说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化； (2)设计PCR引物 选择肠出血性大肠杆菌O157 = H7的0-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌的LT基因、肠致病性大肠杆菌的基因和肠侵袭性大肠杆菌的invasion plasmid基因作为祀基因，设计合成以下引物进行靶基因的扩增 肠出血性大肠杆菌O157 = H7 0-antigen基因的PCR扩增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 肠毒素性大肠杆菌LT基因的PCR扩增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'，ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 肠致病性大肠杆菌6//7A基因的PCR扩增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 肠侵袭性大肠杆菌invasion plasmid基因的PCR扩增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'，EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'； 利用设计合成的靶基因PCR引物，分别以肠出血性大肠杆菌O157 = H7 (ATCC 35150)、肠毒素性大肠杆菌(ATCC 35401)、肠致病性大肠杆菌(ATCC 11775)和肠侵袭性大肠杆菌(ATCC 43893)的基因组DNA为模板扩增靶基因，将扩增的靶基因序列进行BLAST比对分析，分别选取每种致腹泻性大肠杆菌靶基因序列的保守区设计合成了 4对特异性多重PCR鉴定引物 肠出血性大肠杆菌O157 = H7 OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 肠毒素性大肠杆菌LF :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 肠致病性大肠杆菌BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 肠侵袭性大肠杆菌IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'； (3)阳性质控标准品的制备 采用PCR法分别扩增肠出血性大肠杆菌0157:H7 0-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌LT基因、肠致病性大肠杆菌基因和肠侵袭性大肠杆菌invasion plasmid基因，分别将PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒； (4)PCR反应体系 单重PCR反应体系，如下表
5.一种四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测用试剂盒，其特征在于包括权利要求I所述的引物组。
全文摘要
本发明涉及一种基于多重PCR技术快速检测四种致腹泻性大肠杆菌的方法及其专用引物。分别选择肠出血性大肠杆菌O157:H7O-antigen基因、肠毒素性大肠杆菌LT基因、肠致病性大肠杆菌bfpA基因和肠侵袭性大肠杆菌invasionplasmid基因为靶基因，通过基因序列的比对分析，选取靶基因序列的保守区设计合成引物，具体引物如序列表SEQ ID No.1-8所示，建立多重PCR检测方法，对4种致腹泻性大肠杆菌进行定性检测。本发明方法具有较强的检测特异性。本发明还涉及到检测用试剂盒，还具有快速简单，准确性高，灵敏度好的优点。
文档编号C12Q1/68GK102851384SQ20121035672
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者徐义刚, 李丹丹, 刘忠梅, 吴岩, 刘新亮, 李苏龙 申请人:黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心