专利名称：：一种耐热木聚糖酶的生产方法及其在饲料中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及本发明涉及生化酶领域，特别是涉及一种耐热木聚糖酶的生产方法并提供该耐热木聚糖酶在饲料中的用途。
背景技术：
：木聚糖是一种多聚五碳糖，主链是由多个吡喃木糖基通过1,4-木糖苷键相连。侧链上连着多种大小不同的短的取代基，通过木糖残基上的02和03原子与阿拉伯糖残基相连，所以又称为阿拉伯木聚糖。有时阿拉伯木聚糖分子中还含有少量其它侧链残基，如六碳糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸。阿拉伯木聚糖通过这些残基以共价键结合在细胞壁的其它成分上。阿拉伯糖侧链的数量和分布随谷物种类和品种的不同而变异，阿拉伯糖和木糖的比例大约为0.65-0.74:1。阿拉伯木聚糖的取代降低了主链化学键的作用力，从而使其具有水溶性和粘稠性，侧链数量越多，阿拉伯糖基的取代程度越高，水分子越容易渗入，溶解度就越大。根据溶解性可将木聚糖分为水溶性木聚糖(25%~30%)和不溶性木聚糖两大类(约占70%~75%)。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁上，处于木质素和其它多聚糖之间，起着连接作用。飼料原料不同，其中木聚糖含量差别很大。木聚糖是影响麦类原料在饲料中应用的最主要抗营养因子，小麦、黑麦和黑小麦中主要含有大量水溶性阿拉伯木聚糖。实际上，在我国最常用的饲料原料玉米、豆粕中，木聚糖也是最主要的抗营养因子，玉米中木聚糖含量在3.7%~4.4%,占细胞壁总成分的40%左右，是玉米中含量最高的抗营养因子。豆粕中木聚糖的含量也达到6%,此外，在其他一些加工副产物如麸皮、米糠以及杂粕中木聚糖的含量更高。因此，木聚糖在各种伺料原料中普遍存在，是伺料中最主要的抗营养因子之一。表l:常见飼料原料中非淀粉多糖的种类及含量(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>木聚糖的抗营养作用主要表现在:1.增加肠道食糜黏度，影响动物消化吸收单胃动物本身不能分泌分解木聚糖的酶。当动物采食含水溶性木聚糖高的祠料时，可溶性木聚糖在动物肠道内形成粘性物质，提高肠道内容物的黏度。黏度的上升降低了肠道内食糜通过消化道的速度，导致釆食量下降，妨碍消化液与底物的混合，延緩消化酶对底物的消化。同时，降低肠道内食糜中营养物质在肠道内的扩散速度，妨碍养分吸收。2.影响消化道内源酶活性，刺激消化器官代偿性增大阿拉伯木聚糖也可直接与肠道中胰蛋白酶、脂肪酶等消化酶络合，降低消化酶的活性，当单胃动物采食含水溶性高的饲料时，由于对营养成分消化不充分，可刺激动物代偿性地大量分泌消化液，从而使动物胰脏、肝脏等消成内源性氮的损失增加。3.影响脂肪的消化吸收木聚糖在肠道内能相互结成网状物，降低了詞料的扩散率，阻止脂肪与胆盐结合，不能形成脂肪微粒，抑制了脂肪的消化吸收。4.促使肠道有害微生物的增殖，影响动物健康肠道黏度的增加导致营养物质在肠道内蓄积，形成富含养分的食糜，使微生物在这里发酵，损害肠道黏膜正常的形态和功能。对于家禽，湿润的粪便易黏附在泄殖腔周围，污染禽和禽蛋，并提供微生物发酵的场所，从而产生大量的氨气，并可促使真菌孢子繁殖，不利家禽的健康。5.物理屏障作用，影响养分的消化木聚糖作为细胞壁的主要成分，包裹营养物质，隔离减少了营养物质与消化液的接触面积，降低饲料中养分的利用率。伺用酶制剂是指利用微生物技术生产的胞外酶，用作铜料添加剂。祠用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高禽畜及鱼类的生产性能，又能减少禽畜排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染。近几年，随着人们生活水平的提高及环保意识的增强，饲用酶制剂作为高效、无毒副作用和环保型的"绿色"飼料添加剂，在农业生产上得到了广泛推广应用。伺料中使用的酶制剂种类和功效列举如下1.半纤维素酶与木聚糖酶木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种，约占细胞干重的35%,是谷物籽实中的主要非淀粉多糖之一，它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面，进而影响动物的消化吸6收，降低了饲料的营养价值。木聚糖酶类专一降解木聚糖，具有很大的商业开发价值。飼料工业中添加木聚糖酶可以为畜禽生产带来良好的生产效果和经济效益。许多试验表明，添加木聚糖酶可以提高畜禽的生产性能。其主要作用才几理如下(1)降解木聚糖，降低肠道食糜黏度，破坏植物细胞壁结构，消除其抗营养作用，改善动物生产性能。提高饲料代谢能，促进养分吸收利用，增强铜料和养殖企业贏利能力。(2)消除木聚糖对内源酶的抑制，防止消化器官代偿性肥大。(3)生成大量功能性寡糖(木二糖、木三糖等)，改善肠道微生物区系，减少胃肠道疾病，增进动物健康。(4)减少伺料原料品质变异造成的饲料产品质量波动，稳定产品质量，减少投诉。(5)拓宽饲料原料使用范围，加大非常规饲料如麸皮、次粉、米糠等在祠料中的用量，降低飼料配方成本。(6)增加营养物质的吸收利用，减少粪便排放，保护环境，同时减少粪便有机物质分解产生的有害气体对畜禽的刺激，减少呼吸道疾病的发生。木聚糖酶要广泛经济高效的应用于詞料工业应具备一定条件。例如，猪胃中的pH—般为23.5,十二指肠、空肠和回肠的pH范围分别为46、5.56.7和7.07.5，因此要求饲用木聚糖酶在pH较广的范围内能保持较高的活性。另一方面，现在颗粒料制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度在7593°C，多数木聚糖酶在此高温下会大幅度地丧失活性；同时，饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是猪正常体温(37。C)的胃肠中，因此能耐制粒高温，且在动物正常体温下具有较高活性成为木聚糖酶在生产中应用的关键。2.纤维素酶纤维素酶是一类能分解纤维素的酶类通称。在饲料中添加纤维素酶一方面可以破坏富含纤维素的细胞壁，使被其包围的淀粉、蛋白质等营养成分得以释放并被消化利用；另一方面可使纤维素被降解成为可吸收利用的糖。3.植酸酶植酸酶能将麸皮、米糠中不被畜禽利用的植酸(肌醇六磷酸)分解出六个单位的磷酸供畜禽使用。单胃畜禽由于缺乏植酸酶，所以有些口粮必须添加大量无4几磷。饲料中添加才直S臾酶后可以少加或不加磷矿物添加剂，减少畜禽随粪便排出的无机磷对环境的污染。4.果胶酶果胶酶是一类分解果胶质的酶。果胶酶可裂解单糖之间的糖苷键，并脱去水分子，分解包裹在植物表皮的果胶,降低肠道内容物的粘度,并促使植物组织的分解。果胶酶与木聚糖酶合用能降低铜料在畜禽消化道内的粘度，有利于消化酶与营养物质接触和降解，并可抑制肠道有害微生物的生长。5.P-葡聚糖酶(3-葡聚糖是由葡萄糖依靠P-1,3葡萄糖苷键与(3-1,4糖苷键连结而成的多糖。多存在于大麦、燕麦等谷物中,可溶于水形成粘性的凝胶，成为一种抗营养因子,阻碍动物(特别是幼畜)对营养物质的利用,使其生长下降，(3-葡聚糖酶可水解(3-葡聚糖,降低肠道内容物的粘度。6.蛋白酶蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类，是农业上应用最多的酶制剂之一。蛋白酶制剂的种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，等等。蛋白酶广泛存在于人和动物的消化道中，在植物及微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，农业上用蛋白酶制剂主要通过微生物发酵来生产，所以祠用蛋白酶主要来源于微生物，生产蛋白酶的微生物种类很多，有细菌和真菌，如芽孢杆菌属、曲霉属、青霉属等等。在单胃动物饲料中添加蛋白酶主要有两大作用，一是补充动物体内源蛋白酶的不足。幼猪和幼禽消化系统发育不完善，产酶不足，微生物活性较低，在饲料中添加蛋白酶就可以帮助幼龄动物对蛋白质的消化。二是消除抗营养因子的作用。铜料中植物性成分，特别是豆类植物，广泛存在蛋白酶抑制剂和凝集素，它们对饲料营养价值有很大影响，不过对家禽而言，还有待进一步的研究。实验表明，许多微生物蛋白酶可以降解动物消化道中对蛋白酶有抑制作用的蛋白酶抑制剂和凝集素，消除它们的影响，减轻这些因子的抗营养作用。7.淀粉酶淀粉一般是由直链淀粉和支链淀粉组成。主要用于詞料工业的淀粉酶有淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。支链淀粉酶的特点是，能专一性的切开支链淀粉和糖原等分支点的l-6糖苷键，形成直链淀粉。所以将该酶与其他淀粉酶配合使用，可使淀粉完全糖化。近年来支链淀粉酶作为淀粉酶中的一个新品种应用于饲料工业和食品工业。目前铜料中的主要成分是玉米，其中支链淀粉难以利用，造成飼料的浪费。如添加一定的支链淀粉酶，再在动物内源和外源淀粉酶的作用下，就能很好的消化吸收，提高詞料利用率，降低成本。
发明内容本发明的目的是提供一种能耐制粒高温，且在动物正常体温下、在pH较广的范围内具有较高活性的耐热木聚糖酶，并提供该耐热木聚糖酶的生产工艺及其在饲料中的用途。木聚糖酶的生产可采取固体发酵和液体发酵两种途径，虽然针对真菌液体发酵产酶条件的研究很多，方法较为成熟。但由于液体发酵对设备要求4交高，投入较大，生产成本也较高。所以本发明采用固体发酵，其优点为使用的培养基非常简单便宜(玉米芯干粉+料水)；原料处理简单；产物提取9容易，固体发酵后的物料粉碎后就是产品，整个过程无废物排出；培养基含水量小，减少了污染杂菌的机会等。本发明的耐热木聚糖酶的生产方法，采用嗜热真菌DSM10635为生产菌种，通过固体发酵方法生产耐热木聚糖酶。其酶产品无需进一步提纯，与培养基一起干燥后使用于饲料工业。嗜热真菌所分泌的木聚糖酶已完成安全评估，按美国食品药品监督管理局(FDA)的评价标准证实可以按需要量添加使用。所述嗜热真菌DSM10635从德国菌种保藏中心购买获得。购得的菌株在PDA培养基培养获得孢子，紫外照射诱变得到更高产的菌抹。筛选办法为RBB-木聚糖琼脂平板筛选法。所得到的木聚糖酶蛋白质数据库编号为1YNA，理论分子量为21294.96Dalton,实际检测到分子量为21295.17Dalton。共有194个氨基酸，其氨基酸序列为(从N端到C端，l-194位氨基酸)xttpnsegwhdgyyyswwsdggaqatytnleggtyeiswgdggnlvggkgw叩glnaraihfegvyqpngnsylavygwtmplveyyivenfgtydpssgatdlgtvecdgsiyrlgkttrvnapsidgtqtfdqywsvrqdkrtsgtvqtgchfdawaraglnvngdhyyqivategyfssgyaritvadvg本发明的耐热木聚糖酶还可以通过培养其它分泌耐热木聚糖酶的微生物来完成，包括但不限于基因工程改造的工程菌。本发明的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于包括如下生产步骤(1)玉米皮、玉米芯和玉米秆中的任意一种为原料，将其粉碎至直径为0.53毫米的颗粒后用水浸湿23小时，蒸汽杀菌后冷却到50~55°C,获得底物；(2)将步骤(1)的底物与緩冲液以1:2.8~1:3.6的料水比例混合均匀，形成培养基；所述緩冲液由酵母浸出汁与磷酸二氢钾组成；酵母浸出汁浓度为510g/l,磷酸二氢钾浓度为25g/l;所述缓冲液的pH=6.06.5;(3)嗜热真菌按8%的接种量(体积比)接种在所述培养基上，在50~55。C的发酵温度下培养912天，菌体在整个培养基上繁殖；(4)干燥从步骤(3)得到的发酵后的培养基得到木聚糖酶产品，将其进一步磨粉后过筛，得到酶活性大于10000IU/g的粉末状的嗜热木聚糖酶；所述筛为60100目的筛。优选地，在步骤(3)中，在所述的培养基中添加0,2%(重量比)的甘油。本发明的耐热木聚糖酶在饲料中的用途，其特征在于所述耐热木聚糖酶作为饲料添加剂使用，所述耐热木聚糖酶在所述飼料添加剂中的含量为100%，每千克所述饲料中的所述祠料添加剂的含量为0.030.3克。优选地，每千克所述饲料中的所述饲料添加剂的含量为0.1克。本发明的耐热木聚糖酶在祠料中的用途，其特征在于所述耐热木聚糖酶与其他酶混合制成饲料复合酶制剂使用，在每千克所述饲料中，所述饲料复合酶制剂的含量为0.010.3克，所述其他酶是蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和植酸酶中的任意一种或多种的组合，所述耐热木聚糖酶的用量大于所述其它酶。优选地，每千克所述伺料中的所述耐热木聚糖酶的含量为1000IU。在饲料中添加含有耐热木聚糖酶的酶制剂的显著效果在于提高饲料的转化比，同时可以更广泛的采纳利用廉价饲料原料组成饲料配方。按照不同阶段和饲养动物要求，饲料复合酶制剂将按照设计剂量混合不同种类的酶制成复合酶制剂。具体的酶品种和配方将依据不同饲养要求设计。例如，针对利用豆粕替代鱼粉的鸡料配方，可以多添加耐热蛋白酶；对于含小麦或高粱的饲料配方，多添加耐热(3-葡聚糖酶和耐热果胶酶；对于幼畜禽伺料配方，适量添加耐热蛋白酶和耐热淀粉酶。在所有这些饲料复合酶制剂中，木聚糖酶、纤维素酶和植酸酶均应该添加，且木聚糖酶起关键作说明书第9/ll页用，酶活力用量也最大。图1表示本发明的耐热木聚糖酶的生产流程图图2表示本发明的底物对嗜热真菌DSM10635生产木聚糖酶的影响结果示意图。其中，底物l为松木屑、2为桦木屑、3为麸皮、4为玉米杆、5为玉米芯、6为玉米皮。图3表示发酵温度对嗜热真菌DSM10635生产木聚糖酶的影响结果示意图。图4表示料水比例对嗜热真菌DSM10635生产木聚糖酶的影响结果示意图。具体实施例方式本发明的耐热木聚糖酶的生产流程图如图l所示利用嗜热真菌DSM10635的本发明的耐热木聚糖酶的生产1.底物的选择如图2所示，嗜热真菌DSM10635在50。C下，以廉价的玉米皮、玉米芯、玉米秆、麸皮、阔叶(白杨)和针叶(红松)为原料进行产酶的研究，得到酶产量的大小顺序为玉米皮培养基(1673.54IU/g)>玉米芯培养基(1306.34IU/g)>玉米秆培养基(379.07IU/g)>麸皮培养基(155.09IU/g)>阔叶木培养基(19.11IU/g)>针叶木培养基(2,03IU/g)。该结果表明玉米皮和玉米芯为嗜热真菌DSM10635在50。C下生产耐热木聚糖酶的最佳诱导底物，在酶工业生产中应用将大大降低生产成本，具有重要的经济价值。2.底物颗粒大小的选择以不同直径的玉米芯(0.1cm、0.2~0.3cm和0.5~lcm)颗粒作为培养底12物，且玉米芯培养基组分构成均为33.33%(重量百分比)玉米芯颗粒和66.67%(重量百分比)的由酵母浸出汁和磷酸组成的緩沖液(pH6.5)，用嗜热真菌ThermomyceslanuginosusDSM10635按8%体积比的接种量接种后在50。C进行固体发酵生产木聚糖酶，得到的木聚糖酶的酶活力分别为1228.75IU/g、948.59IU/g和599.39IU/g。上述结果表明，酶产量大小的顺序为小颗粒(粒径O.lcm)玉米芯培养基>中颗粒(粒径0.2~0.3cm)玉米芯培养基>大颗粒(粒径0.5lcm)。小果页并立玉米芯(丰立4圣<0.1cm)为p耆热真菌ThermomyceslanuginosusDSM10635生产木聚糖酶的最佳诱导底物。3.发酵温度的选择选择一个合适的发酵温度对于保证菌体生长与酶产物合成的顺利进行很重要。如图3所示，本发明以20。/。玉米芯干^f分(重量百分比)和80%(重量百分比)的由酵母浸出汁和磷酸组成的緩冲液(pH6.5)为培养基的组分构成，用嗜热真菌ThermomyceslanuginosusDSM10635按8%(体积百分比)的接种量接种后，分别在45、50、55、60和65。C下进行培养发酵产酶，得到的木聚糖酶的酶活力分别为4192.62IU/g、4686.05IU/g、3卯1.71IU/g、1887.54IU/g和727.68IU/g。该结果表明嗜热真菌ThermomyceslanuginosusDSM10635在5CTC发酵产酶时酶活力最高，温度过高或过低均不利于产酶。4.培养基料水比例的选择培养基的料水比例对木聚糖酶的生产有明显的影响。料水比例太大,会引起固体基质物理性质发生变化，从而影响氧的传输和发酵热的散失，同时也会引起培养基表面粘连，造成培养基溶氧量不足，容易导致发酵不彻底，培养基利用率下降，从而酶产量降低。料水比例过低，基质内水活度下降，13不利于营养物质的溶解与传递，也会使孢子萌发的迟滞期延长，进而影响菌丝体的生长周期，导致酶产量较低。因此，适当水分含量的培养基不仅对菌抹的生长至关重要，而且是木聚糖酶合成的关键因素。如图4所示，本发明的嗜热真菌DSM10635在料水比分别为1:2.4、1:2.8、1:3.2、1:3.6和1:4.0的玉米芯固体培养基上于50。C下发酵产酶，得到的木聚糖酶产品的酶活力分别为1644.04IU/g、2845.96IU/g、2350.56IU/g、2174.92IU/g和1730.11lU/g。上述结果表明，培养基料水比例为1:2.8时，菌抹的酶产量达到最大。增加或减少培养基的含水量,酶产量均显著降低。5.最大木聚糖酶产量的结果比较本发明还进行了下述实验，以确定营养因子与诱导效果的关系在1000ml大烧杯中，按照重量百分比，加入25%玉米芯千粉、74.8%的緩沖液(pH6.5)和0.2%的甘油，所述緩冲液由酵母浸膏(10g/L)、牛肉膏(10g/L)和KH2P04(5g/L)组成，将混合物搅拌均匀后，分装到锥形瓶中，以8%(体积百分比)的接种量接种嗜热真菌DSM10635，放置培养箱中，在5(TC下发酵9天。结果发现，每克绝干玉米芯培养基的酶产量达到12525.80IU，是目前国内固体发酵产木聚糖酶的较高产量，高于国内其它菌抹的产量。刘月英等利用棒曲霉UA22菌林进行固态发酵，所产木聚糖酶活力为2696IU/g;蔡敬民等筛选了一抹高产木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillusniger)A3菌抹,研究其在固体培养基中的发酵条件，得到的木聚糖酶活力也只达5147IU/g培养基干重。以上所用的微生物不仅产量低，而且所产木聚糖酶的热稳定性和耐酸碱度性能都没有嗜热真菌DSM10635好。与之相比，本发明的利用嗜热真菌DSM10635固体发酵生产得到的耐热木聚糖酶，其产率高，酶耐热性耐酸碱度好，而且不产生纤维素酶。拥有这些独特优点的DSM10635菌抹具有广阔的应用前景。权利要求1、耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于包括如下生产步骤(1)玉米皮、玉米芯和玉米秆中的任意一种为原料，将其粉碎至直径为0.5～3毫米的颗粒后用水浸湿2～3小时，蒸汽杀菌后冷却到50～55℃，获得底物；(2)将步骤(1)的底物与缓冲液以1∶2.8～1∶3.6的料水比例混合均匀，形成培养基；所述缓冲液由酵母浸出汁与磷酸二氢钾组成；酵母浸出汁浓度为5～10g/l，磷酸二氢钾浓度为2～5g/l；所述缓冲液的pH＝6.0～6.5；(3)嗜热真菌Thermomyceslanuginosus按8％的接种量(体积比)接种在所述培养基上，在50～55℃的发酵温度下培养9～12天，菌体在整个培养基上繁殖；(4)干燥从步骤(3)得到的发酵后的培养基得到木聚糖酶产品，将其进一步磨粉后过筛，得到酶活性大于10000IU/g的粉末状的嗜热木聚糖酶；所述筛为60～100目的筛。2、根据权利要求1所述的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于在步骤(3)中，在所述的培养基中添加0.2%(重量比)的甘油。3、根据权利要求1所述的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于所述料水比例为1:2.8。4、根据权利要求1所述的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于在步骤(1)的原料为玉米芯，所述粒径为lmm。5、根据权利要求1所述的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于步骤(3)中的所述发酵温度为50°C。6、根据权利要求1所述的耐热木聚糖酶的生产方法，其特征在于所述嗜热真菌为嗜热真菌DSM10635,所述耐热木聚糖酶，属于第U酶家族，属于蛋白质数据库编号为1YNA。7、用权利要求1的生产方法得到的耐热木聚糖酶在飼料中的用途，其特征在于所述耐热木聚糖酶作为祠料添加剂使用，所述耐热木聚糖酶在所述铜料添加剂中的含量为100%,每千克所述飼料中的所述飼料添加剂的含量为0.030.3克。8、根据权利要求7的耐热木聚糖酶在飼料中的用途，其特征在于每千克所述饲料中的所述飼料添加剂的含量为0.1克。9、用权利要求1的生产方法得到的耐热木聚糖酶在饲料中的用途，其特征在于所述耐热木聚糖酶与其他酶混合制成铜料复合酶制剂使用，在每千克所述祠料中，所述饲料复合酶制剂的含量为0.01~0.3克，所述其他酶是蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和植酸酶中的任意一种或多种的组合，所述耐热木聚糖酶的酶活力用量大于所述其它酶。10、根据权利要求9的耐热木聚糖酶在饲料中的用途，其特征在于每千克所述饲料中的所述耐热木聚糖酶的含量为IOOOIU。全文摘要本发明描述了利用嗜热真菌DSM10635生产耐热木聚糖酶的生产方法以及所述耐热木聚糖酶在饲料中的用途。作为饲料添加剂这种耐热木聚糖酶可直接使用或混合其它酶制成复合酶制剂使用。其优点为使用的培养基非常简单便宜(玉米芯干粉+料水)；原料处理简单；产物提取容易，固体发酵后的物料粉碎后就是产品，整个过程无废物排出；培养基含水量小，减少了污染杂菌的机会。文档编号C12N9/24GK101487000SQ20091011910公开日2009年7月22日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者熊海容申请人:熊海容