一种连续发酵生产木聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物酶制剂生产技术领域，具体地涉及一种连续发酵生产木聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002]木聚糖酶是指可将半纤维素降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切0~1，4~木聚糖酶、内切β~1，4~木聚糖酶和木聚糖酶。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。木聚糖酶用作饲料酶制剂，可以有效解除木聚糖的抗营养作用，促进畜禽对粗饲料的消化吸收。木聚糖酶作为新型的纸浆漂白助剂，降低漂白用氯，解决纸浆工业中的环境污染问题。在纤维素燃料乙醇的生产实践中，添加木聚糖酶可剥离木质素与纤维素之间的聚合态，易于酶解过程中的酶与底物的充分接触，利于酶解反应的发生，同时能够分解半纤维素成为酵母可利用的单糖，提高出酒率，降低纤维乙醇的成本。随着纤维素乙醇产业化进程的加快，木聚糖酶的开发研究更加备受关注。
[0003]酶制剂生产通常以分批补料发酵和连续发酵两种方式为主，较之于分批补料发酵，连续发酵可以提高设备的利用率和单位时间产量，只保持一个期的稳定状态；减少分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等操作时间，提高生产效率；连续培养生产出的发酵产品，质量比较稳定；发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制。
[0004]专利CN102776166A公开了一种木聚糖酶生产方法，利用黑曲霉菌(Asperillusniger),以乳糖为主原料，采取液体深层发酵法生产木聚糖酶，其特征在于:在发酵过程中连续补加发酵培养基，并在一个发酵周期内间断的从发酵罐中放出发酵醪液；所得发酵醪液经板框过滤，得到木聚糖酶液，再经过超滤浓缩和喷雾干燥，得高活力木聚糖酶粉状产品。采用高效连续的补加发酵培养基料和间断出醪法相结合；在相同原料量投入的情况下，每小时单位发酵体积产生的木聚糖酶发酵液提高71.9%，总产量提高约29%，单位原材料成本减低约22%。但木聚糖酶的活力水平较低。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对分批补料的不足，提供一种连续发酵生产木聚糖酶的方法，在不增加设备投资成本的情况下，大幅提高设备利用率，增加产能，降低单位酶活力发酵成本，稳定产品质量。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
一种连续发酵生产木聚糖酶的方法，以绿色木霉为菌种，主要包括以下步骤:
I)菌种的制备及扩大培养:将绿色木霉菌株Trichoderma viride CGMCC N0.5832转接至PDA斜面培养基上，30°C，培养7天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基中，于180~220r/min，28~32°C条件下，培养18~24h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.3-0.5体积％的接种量接入一级种子罐中，于28~32°C，通气比1:0.6-0.8的条件下，培养18~20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以8~10体积％的接种量接入二级种子罐，于28~32°C，通气比1:0.6-0.8的条件下，培养8~12h，得到二级种子液；
2)补料发酵培养:在发酵罐Fl中加入基础培养基，装料系数为30~40体积％，调节pH值为4.5-5.0，灭菌；待基础培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以基础培养基体积8~12%的接种量接入所述二级种子液，接种后0~8h，通气比为1:0.6-1.5，搅拌转速为100~200r/min，培养温度为30~32°C ;接种8h以后，通气比1:1.5~2.0，搅拌转速100?300r/min，培养温度28~30°C ;当还原糖浓度在0.3重量％以下时，开始连续流加补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵液体积的0.7-1.2%，当发酵液体积达到发酵罐Fl容积的70~80%时，将发酵罐Fl中1/2体积的发酵液导入二级发酵罐F2，以与发酵罐Fl相同的补料速率连续补料培养，剩余的1/2体积的发酵液继续连续补料培养^#F1、F2的发酵液体积分别达到发酵罐容积的70~80%，以0.005-0.ΟΙ/h稀释率D向F1、F2流加补料培养基，同时以与补料相同的速率，由F1、F2共同向下一级发酵罐F3连续输出发酵醪液，待F3发酵液体积与F1、F2分别相等时，终止发酵，发酵周期为7~10天；稀释率D定义为:补料培养基的补加速率M与发酵罐中发酵液体积V的比值，M的单位为L/h，V的单位为L ;
3)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液采用有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；然后加入防腐剂，得液体木聚糖酶产品；
4)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣作为原料用于沼气发电。
[0007]步骤I)中所述三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的组成均为，以质量百分比计，葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水。
[0008]步骤2)中所述基础培养基组成为，以质量百分比计，葡萄糖2~3%，乳糖0.5-1.0%，玉米浆2.0-3.0%，硫酸铵0.4-0.6%，磷酸二氢钾0.2-0.4%，硫酸镁0.1-0.2%，氯化钙0.05-0.1%，微量元素0.05-0.2%，余量为水。
[0009]步骤2)中所述补料培养基组成为，以质量百分比计，玉米浆1.5-2.0%，硫酸铵0.5-0.7%，磷酸二氢钾 0.4-0.6%，硫酸镁 0.2-0.4%，氯化钙 0.1-0.2%，微量元素 0.05-0.1%，其余为淀粉酸解液；所述淀粉酸解液中葡萄糖的含量为15~20重量％。
[0010]所述淀粉酸解液是通过如下制备方法获得的:用0.4-0.6重量％的盐酸溶液将淀粉配制成15~20重量％的淀粉浆，于110~115°C下酸解30min，酸解结束后用氢氧化钠调节pH值至4.5~5.0之间，备用。
[0011]进一步的，所述微量元素的组成为，以质量百分比计，钼酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%，余量为水。
[0012]进一步的，步骤3)中所述有机膜为膜分子量为10000道尔顿的有机膜。
[0013]进一步的，步骤3)中所述防腐剂的组分配比为:氯化钠7g~10g，苯甲酸钠0.1g?0.3g0
[0014]由于本发明一种连续发酵生产木聚糖酶的方法，包括I)菌种的制备及扩大培养、
2)补料发酵培养、3)木聚糖酶的提纯和4)发酵液残渣的处理，该方法无废弃物排出，环保无污染，具有以下有益效果:
(I)本发明方法采用连续发酵，能够在不增加固定资产投入的情况下提高设备利用率，提高产能，提高酶活力水平，并使生产效率提高20~30%。
[0015](2)本发明方法可降低单位酶活力发酵成本，保证产品质量稳定；单位酶活力发酵成本降低10~15%，批次之间酶活力水平偏差低于5%。
[0016](3)本发明所产生的菌体残渣含有一定的氮源，用于沼气发电可减少环境污染，同时生产清洁能源。
【具体实施方式】
[0017]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
[0018]本申请是发明人在2014年申请的申请号为2014106385309 —种木聚糖酶的液态深层发酵方法的基础上，跳出传统思维局限，经过深入探索和研究，积极提出的全新的木聚糖酶生产方法。本申请以申请号为2014106385309的专利文件中记载的实施例3为对比例1，进一步阐述本发明的创新性。对比例I的具体实施细节在该专利文件中有详细而明确的记载，不再赘述。
[0019]对比例I中，木聚糖酶的酶活力为3485.65U/mL，单罐单批发酵液总量97.6吨。
[0020]本发明中，所述PDA斜面培养基的配方为:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升、自然PH，其制作方法为本领域