重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年6月30日、申请号为201180036314. 1、发明名称为"重 建高密度脂蛋白制剂及其生产方法"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及重建的高密度脂蛋白制剂。更特别地，本发明涉及毒性降低的重建高 密度脂蛋白制剂。
[0003] 背景
[0004] 高密度脂蛋白（HDL)是一类含有脂质和蛋白质的异源脂蛋白，其特征在于高密度 (>1. 063g/mL)和小的尺寸（Stoke's直径=5至17nm)。各种HDL亚类的脂质、载脂蛋白、 酶和脂质转移蛋白的含量和质量不同，导致形状、密度、大小、电荷和抗原性的不同。载脂蛋 白A-I(Apo-AI)是主要的HDL蛋白，尽管可能存在其他载脂蛋白，如Apo-AII和Apo-V。
[0005] 流行病学和临床研究已经确定了高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)水平与心血管疾 病风险之间的逆相关（Assmann等的综述，2004，Circulation109111-8)。更特别地，重建 HDL制剂的临床给药已经显示出能给患有近期急性冠脉综合征（ACS)的患者提供益处。
[0006] 通常，这样的重建HDL制剂包含如Apo-AI这样的蛋白质，如磷脂酰胆碱这样的 脂质以及如胆酸盐或脱氧胆酸盐这样的去污剂。此外，可以包括胆固醇。如美国专利 5, 652, 339中公开的，不使用有机溶剂生产重建的HDL制剂是有利的，在某些情况下，生产 重建HDL制剂时，有机溶剂用于溶解脂质成分（例如，磷脂酰胆碱）。在临床上试验了这种 类型的称为CSL-111的重建HDL制剂，但早在肝功能测试异常后就没有继续较高剂量的治 疗了。用CSL111治疗的患者在斑块负荷指数中显示出有益趋势。然而，与安慰剂比较时， 在动脉粥样化体积的百分比变化或斑块体积的标称变化中没有获得统计学显著性（Tardif 等，2007,JAMA-Exp. 297E1)。
[0007] 概述
[0008] 本发明的目的是提供一种重建的HDL制剂，其减轻或避免了现有技术重建HDL制 剂的一个或多个缺点。
[0009] 本发明的优选目的是提供一种毒性降低或最小化的重建HDL制剂。
[0010] 本发明的另一个优选目的是提供一种重建HDL制剂，其在包括但不限于冠状动脉 粥样硬化的疾病或病症的预防性和/或治疗性处理中是有效的。
[0011] 本发明宽泛地涉及一种脂蛋白制剂，其包含载脂蛋白、磷脂和去污剂，其水平是无 毒的，或至少呈现出相对低的毒性。在特定的实施方案中，去污剂和脂质的水平处于低于引 起、导致肝毒性或与肝毒性相关的水平。
[0012] 在一个方面中，本发明提供了一种重建高密度脂蛋白（rHDL)制剂，其包含载脂蛋 白或其片段；脂质；和去污剂，其水平为给予人时呈现出肝毒性的rHDL制剂中存在的去污 剂水平的约5-50%。
[0013] 在另一个方面中，本发明提供了一种生产包含载脂蛋白；脂质；和去污剂的rHDL 制剂的方法，所述方法包括提供所述去污剂的步骤，所述去污剂的水平为给予人时呈现出 肝毒性的rHDL制剂中存在的去污剂水平的约5-50%。
[0014] 在再另一个方面中，本发明提供了一种治疗人疾病、障碍或病症的方法，包括将根 据本发明第一个方面的rHDL或根据第二个方面的方法生产的rHDL给予人的步骤，以由此 治疗人的所述疾病、障碍或病症。
[0015] 在再另一个方面中，本发明提供了根据第一个方面的rHDL制剂或根据第二个方 面的方法生产的rHDL制剂，用于治疗人的疾病、障碍或病症。
[0016] 优选地，去污剂的水平为呈现出肝毒性的去污剂水平的约5-10%。在某些实施方 案中，这等于约0. 03g/g载脂蛋白。
[0017] 优选地，去污剂是胆汁盐或胆汁酸。更优选地，去污剂是胆酸钠。
[0018] 载脂蛋白可以是高密度脂蛋白（HDL)的常规和/或功能性成分的任何脂蛋白。载 脂蛋白优选为约20-50g/L的浓度。优选地，载脂蛋白是Apo-Al或其片段。
[0019] 合适地，脂质的水平为引起肝毒性或与肝毒性相关的脂质水平的约20-70%。优选 地，脂质浓度为约30-60g/L。特别有利的脂质浓度为约30-50g/L，或在某些实施方案中，约 34 或 47g/L。
[0020] 优选地，脂质是磷脂。更优选地，磷脂是或包含磷脂酰胆碱（PC)。
[0021] 在一个优选的实施方案中，载脂蛋白：脂质的摩尔比在1:20至1:100的范围中。 更优选地，载脂蛋白：脂质的摩尔比在1:40至1:75的范围中。载脂蛋白：脂质特别有利 的比例为约1:40或1:55。
[0022] 合适地，rHDL制剂进一步包含稳定剂。优选地，稳定剂是糖，如鹿糖。优选的浓度 为约 65-85g/LrHDL制剂。
[0023] 在整个说明书中，除非文中另外需要，词语"包含（comprise) "，"包含 (comprises) "和"包含（comprising) "将被理解为表示包含所述的整体或整体组，但不排 除任何其他整体或整体组。
[0024] 附图简述
[0025] 参照以下附图，其有助于理解下文详细描述的本发明的非限制性实施方案，其 中：
[0026] 图1显示了急性大鼠研究的结果，表明胆酸盐和磷脂酰胆碱的同时减少降低了肝 毒性；
[0027] 图2显示出急性大鼠研究的结果，表明了胆酸盐的选择性减少降低了肝毒性；
[0028] 图3显示出在不同浓度的胆酸盐存在下，CSL111的浊度分析结果；
[0029] 图4显示出在冷冻干燥和重建后，在不同浓度的胆酸盐的存在下，CSL111的浊度 结果；
[0030] 图5显示出在室温下（RT)，重建HDL1:50PC的浊度分析结果；
[0031] 图6显示出在37°C下，重建HDL1:50PC的浊度分析结果；
[0032] 图7显示出在RT下，重建HDL1:75PC的浊度分析结果；
[0033] 图8显示出在37°C下，重建HDL1:75PC的浊度分析结果；和
[0034] 图9提供了rHDL制剂制造方法的实施方案的概览。
[0035] 详述
[0036] 本发明至少部分地源于出乎意料的发现：在现有技术中所述的由CSL111重建 HDL(rHDL)制剂呈现的肝毒性是由于过量的去污剂引起的，特别是就制剂中的去污剂与Apo-AI的比例来考虑时。在这点上，胆酸钠的水平为约0. 3g/gApo-AI。然而，本发明人还 发现了不能全部消除去污剂并且必须保留一定水平，由此rHDL制剂呈现出充分的稳定性 和治疗活性。
[0037] 此外，出乎意料地发现了与CSL111中存在的相比，脂质浓度的降低减轻了肝毒 性，而基本上没有损害rHDL制剂的治疗活性。
[0038] 在进一步的发现中，鉴定出对rHDL制剂最佳的载脂蛋白：脂质的摩尔比。
[0039] 因此，在一个方面中，本发明提供了一种rHDL制剂，其包含载脂蛋白或其片段；月旨 质和一定水平的去污剂，所述去污剂的水平为给予人时呈现出肝毒性的rHDL制剂中存在 的去污剂水平的约5-50%。
[0040] 如在此所用的，"重建HDL(rHDL) "制剂可以是功能上与血浆中通常存在的高密度 脂蛋白（HDL)相似、类似、相应或模拟的任何人工生产的脂蛋白制剂或组合物。rHDL制剂包 括在"HDL模拟物"和"合成HDL颗粒"的范围内。
[0041] 关于这点，"将rHDL制剂给予人时呈现出肝毒性"意思是给予人后rHDL制剂中存 在的去污剂水平引起、导致此后的不利事件或至少与此后的不利事件相关。通常，不利事件 是肝毒性，如通过异常或受损的肝功能所证实的。异常或受损的肝功能的非限制性实例包 括升高的丙氨酸转氨酶活性（ALT)、升高的天门冬氨酸氨基转移酶（AST)活性和/或升高 的胆红素水平。根据本发明，不会引起、导致不利事件或与不利事件无关的去污剂的合适水 平，如前所述。通常，这将在灌输结束时进行测量。
[0042] 优选地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污剂水平的约5-35%。该范围包括，例 如，5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %和35 %。更优选地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污 剂水平的约5-20%。有利地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污剂水平的约5-10%。优选 地，这些水平以呈现肝毒性的去污剂的最小或极限水平来表示。
[0043] 例如，形成本发明的工作中已经显示出引起、导致肝毒性或至少与肝毒性相关的 去污剂水平为〇.3g/gApo-AI或6g/LrHDL制剂（20g/LApo-AI)。因此，5-10%的该去污 剂水平为 〇· 015-0. 03g/gApo-AI或 0· 5-0. 9g/LrHDL制剂（30g/LApo-AI)。
[0044] 去污剂的"水平"可以是去污剂的绝对量、去污剂的浓度（例如，每单位体积rHDL 制剂的质量）和/或去污剂的量或浓度相对于rHDL制剂的成分的另一个量或浓度的比例。 只是举例，去污剂的水平可以用rHDL制剂中存在的载脂蛋白（例如，Apo-AI)的总质量来 表不。
[0045] 尽管安全性和肝毒性的避免是本发明的一个目的，但本发明还需要足以维持rHDL 制剂稳定性的去污剂水平。如将在实施例中更详细描述的，不低于约〇. 45g/LrHDL制剂 (具有30g/L载脂蛋白）的去污剂浓度就稳定性和无毒性两者而言是最佳的。可以通过本 领域已知的任何方式来有利地测量稳定性，尽管rHDL制剂的浊度是优选的测量方式。
[0046] 去污剂可以是适用于rHDL制剂中的任何离子型（例如，阳离子、阴离子、两性离 子）去污剂或非离子去污剂，包括胆汁酸及其盐。离子型去污剂可以包括胆汁酸及其盐、聚 山梨酸酯（例如，PS80)、CHAPS、CHAPS0、鲸蜡基三甲基-溴化铵、月桂酰肌氨酸、叔-辛基 苯基丙烷磺酸和4' -氨基-7-苯甲酰胺基-牛磺胆酸。
[0047] 胆汁酸通常是具有24个碳的二羟基化或三羟基化类固醇，包括胆酸、脱氧胆酸、 鹅脱氧胆酸或熊果脱氧胆酸。优选地，去污剂是胆汁盐，如胆酸盐、脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸 盐或熊果脱氧胆酸盐。特别优选的去污剂是胆酸钠。
[0048] 载脂蛋白可以是天然产生的HDL或重建高密度脂蛋白（rHDL)的功能性的、生物 活性成分的任何载脂蛋白。通常，载脂蛋白是血浆衍生的或是重建的载脂蛋白，如Apo-AI、 Apo-A