仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ApoA-I及其模拟肽、ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。所述载脂蛋白优选ApoE3及其模拟肽中的一种或多种。本发明首次提出将仿生重组高密度脂蛋白应用于制备预防和治疗阿尔茨海默病药物，解决了天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点，其应用为阿尔茨海默病防治药物研发提供新的思路，具有重要的研究价值和临床应用前景。
【专利说明】仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经药理学和化学制药领域，尤其涉及仿生重组高密度脂蛋白在制备 预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimei^ s Disease, AD)是发生在老年人群中最常见的以进 行性痴呆为特征的中枢神经系统退行性病变。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常 生活能力进行性减退，伴有各种神经精神症状和行为障碍。目前AD在老年人群中的发病率 仅次于心血管病、癌症和脑卒中，已成为排名第四位的致死病因。随着人口老龄化进程的加 剧，该类疾病的发病率日益上升。《世界阿尔茨海默病报告》指出，痴呆患者人数预计每20 年增长近一倍，将由2010年的3600万增至2050年的1. 15亿，且58%的患者居住于中低收 入国家，到2050年，这一数字将增至71% ;报告称，每年痴呆相关费用总计6040亿美元，约 为全球国内生产总值（⑶P)的1%。AD已成为人类健康和生存质量的严重威胁，是日益严重 的公共卫生问题。
[0003] 目前临床上使用的AD治疗药物本质上为对症治疗，包括乙酰胆碱酯酶（AchE)抑 制剂他克林、多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏和谷氨酸NMDA受体拮抗剂美金刚，仅能短期内 改善胆碱能缺失导致的学习、记忆功能下降，但不能改变AD的病理进程。因此，亟需寻找和 建立具有AD疾病修饰作用的新型防治方法。
[0004] 老年斑和神经元纤维缠结是AD的重要病理特征。老年斑的主要组成物质是β -淀 粉样蛋白（amyloidP-protein, Αβ )，而神经元纤维缠结主要由过度磷酸化的Tau蛋白组 成。Α β是由39?43个氨基酸组成的多肽，Α β 40和Α β 42是其两种基本类型，来源于淀粉 样前体蛋白（ΑΡΡΚΑβ具有高度聚集能力，经神经元产生分泌后，会迅速聚集，形成可溶状 态的寡聚体，而后进一步聚集形成Αβ纤维而沉积在脑内。当前的研究明确Αβ是AD的核 心致病物质，其中Αβ寡聚体的神经毒性最强。Αβ在脑内过度产生和沉积，引起其周边神 经元突触功能障碍、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激和继发炎性反应，导致神经元变性死亡， 最终产生痴呆。这就是目前广泛接受的AD病因假说-Α β级联假说（amyloid β cascade hypothesis)。由此，Α β及其聚集体特别是寡聚体成为AD最重要的疾病生物标记物，而如 何降低脑内Αβ水平也成为防治AD的重要策略。
[0005] 减少产生和促进清除是降低脑内Αβ水平的关键手段。自20世纪90年代开始，首 先探讨的是通过抑制Αβ产生的关键酶（β分泌酶和γ分泌酶)活性来减少Αβ的产生。但 是，由于β分泌酶和Υ分泌酶同时参与众多底物的代谢过程，简单地抑制其活性会因干扰 神经元的正常生理功能而产生严重不良反应。Υ分泌酶抑制剂(包括礼来的semagacestat 和施贵宝的avagacestat)在临床试验中相继失败，使得APP代谢调节剂的研发热情跌至冰 点。
[0006] 在AD患者中，90%以上是迟发型病人。这些病人脑内Αβ产生速度与正常人相同， 而Αβ清除速率明显低于正常对照。由此，加快脑内Αβ清除成为AD防治最重要的方向。 免疫治疗是目前用于降低脑内Αβ水平最常用的策略，能够有效预防和清除Αβ沉积、抑制 Αβ寡聚体的毒性作用、降低神经胶质增生、逆转神经突触损伤及改善认知功能。然而，免 疫治疗本身存在一些重要的问题亟需解决：（1)Αβ-抗体免疫复合物诱发的不良反应:Αβ 作为自身抗原，与进入脑内的抗体形成免疫复合物后，将可能诱发继发免疫反应而导致中 枢神经系统炎症和血管壁的损伤，引起脑内炎症、脑微血管出血和血管源性脑水肿等不良 反应；（2)目前有效的抗体都是针对Αβ氨基端的特异性抗体，由于Αβ氨基端的序列位于 Α β前体蛋白（ΑΡΡ)的胞外段，因此这些抗Α β氨基端的抗体也会与神经元的ΑΡΡ结合而导 致正常神经元遭到免疫攻击。鉴于免疫疗法的上述局限性，亟需探索新的降低脑内Αβ水 平的策略。
[0007] 高密度脂蛋白是一种天然的纳米载体，属脂蛋白中粒径最小的成员，由脂质和载 脂蛋白（ΑροΑ-Ι, ΑροΑ-ΙΙ, ApoE或ApoC)构成，介导体内胆固醇的逆向转运，具有抗动脉硬 化、抗氧化、抗炎等功能。神经生物学研究表明，以ApoE为载脂蛋白成分的ApoE-高密度 脂蛋白是脑内最主要的高密度脂蛋白类型，除了参与胆固醇转运外，同时参与Αβ代谢，介 导其脑内降解和清除。该作用依赖于ApoE的亚型（Αρ 〇Ε2?Αρ〇Ε3?Αρ〇Ε4)及其脂化程度 (ApoE-高密度脂蛋白〉ApoE)。脑内ApoE的脂化主要由ABCA1蛋白介导。研究显示，ABCA1 表达升高，脑内ApoE-高密度脂蛋白含量升高，Αβ沉积减少；反之，abcal基因敲除，脑内 ApoE-高密度脂蛋白含量降低，Αβ沉积增加。由此可见，ApoE-高密度脂蛋白在介导脑内 Αβ清除中起关键作用；此外，ApoA-I高密度脂蛋白也也被认为在AD中起着重要作用，同样 可结合Αβ，减小其神经毒性。ApoA-I基因敲除可加速APP/PSlDeltaE9 AD模型鼠 Αβ斑 块沉积，加重记忆障碍；而其高表达可有效减少APP/PS1 AD模型鼠 Αβ在血管壁的沉积，减 少炎症，减轻记忆障碍。基于上述证据，我们认为，高密度脂蛋白具有天然的促进脑内Α β 清除的能力，提高体内高密度脂蛋白水平有望延缓AD疾病进程。
[0008] 天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强。基于仿生学原理构建的 重组高密度脂蛋白为解决该问题提供了一条途径。然而现有重组高密度脂蛋白直接药用仅 见于动脉粥样硬化和糖尿病防治的零星报道，未见其在AD防治方面的应用研究。由此，本 发明首次提出模拟机体天然的Αβ清除机制，构建仿生重组高密度脂蛋白，其体内应用将 促进脑内Αβ清除，对AD疾病进程具有重要的调节作用。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是，提供仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿 尔茨海默病药物中的应用。
[0010] 为了解决上述问题，本发明提供了仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔 茨海默病药物中的应用。
[0011] 作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成。
[0012] 作为一个优选方案，所述脂质通过常规方法制备脂质体，而后与载脂蛋白共同孵 育，通过自组装形成重组高密度脂蛋白，脂质质量占处方含量的20-95%，载脂蛋白质量占处 方含量的5-80%。
[0013] 作为一个优选方案，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ΑροΑ-Ι及其模拟肽、 ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。所述载脂蛋白优选ApoE及其模拟 肽中的一种或多种。
[0014] 作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白采用注射途径给药或者鼻腔途径 给药。
[0015] 作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为l-500nm，优选 5_50nm〇
[0016] 作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白分散在药剂学上可以接受的缓冲 溶液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。
[0017] 作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白可以包载药物，所述仿生重组高 密度脂蛋白包载药物起协同防治阿尔茨海默病的作用，所述药物是指治疗或诊断阿尔茨海 默病的药物，包括小分子化学药物，大分子多肽、蛋白、基因药物中的一种或者多种。
[0018] 本发明所述的脂质可以是天然磷脂(蛋磷脂、豆磷脂)、合成磷脂(磷脂酰胆碱、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂)、鞘脂(鞘 氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂)、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的 一种或多种。
[0019] 所述的脂质体的制备方法采用薄膜水化法、注入法、复乳法、熔融法、冷冻干燥法、 逆向蒸发法、高压乳匀法或超声法及Ca 2+融合法。
[0020] 本发明的优点在于，本发明首次提出将仿生重组高密度脂蛋白应用于制备预防和 治疗阿尔茨海默病药物，解决了天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等 缺点，其应用为AD防治药物研发提供新的思路，具有重要的研究价值和临床应用前景。仿 生重组高密度脂蛋白的体内应用将对AD疾病进程具有重要的调节作用：①进入脑内的重 组1?密度脂蛋白通过1?未和力结合Αβ，增加脑内膜岛素降解酶、金属基质蛋白酶等对Αβ 的胞外降解和小胶质细胞对Αβ的内吞和胞内降解；②降低脑内炎症反应；③血循环中的 重组高密度脂蛋白，高亲和力结合Α β，降低外周游离Α β浓度，发挥外周漏漕效应，促进脑 内Αβ的脑外转运。④此外，重组高密度脂蛋白是一种常用的药物载体，可载带其它药物以 协同防治AD。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为透射电镜观察㈧不载胆固醇酯的重组高密度脂蛋白（圆盘状)和⑶载胆 固醇酯的重组高密度脂蛋白（球形）形态，标尺：20nm。
[0022] 图2为重组高密度脂蛋白和对照脂质体与（A) Α β _单体、（Β) Α β _寡聚体结合 情况的比较，*Ρ〈〇. 05, **ρ〈0. 01，_ρ〈0. 001与重组高密度脂蛋白存在显着性差异。
[0023] 图3为重组高密度脂蛋白与（Α)Αβ ρ42单体、（Β)Αβ ρ42寡聚体的表面等离子共振 结合曲线。
[0024] 图4为与Α β 22 °C共孵育48h后，点印记法考察Αρ〇Ε3溶液和重组高密度脂蛋白对 Αβρ#寡聚体形成的影响，（Α)阴性对照：磷酸盐缓冲液；(Β)Αρ〇Ε3溶液；(C)重组高密度脂 蛋白溶液。
[0025] 图5为与Αβ 37°C共孵育120h后，硫磺素 Τ荧光法考察Αρ〇Ε3溶液和重组高密度 脂蛋白对Αβ 纤丝形成的影响，以各组Oh荧光值为100%，@ρ〈0. 001，表明与阴性对照单 独Α β 孵育组存在显着性差异。
[0026] 图6为重组高密度脂蛋白㈧促进AD模型动物SAMP8小鼠的脑内Α β清除，（B) 减少小胶质细胞激活，#Ρ〈〇. 01，*"ρ〈〇. 001与生理盐水组存在显着性差异；###Ρ〈〇. 001与正 常对照组存在显着性差异。
[0027] 图7为注射给药四周，Morris水迷宫实验考察重组高密度脂蛋白和载α -倒捻子 素重组高密度脂蛋白对8月龄AD模型动物SAMP8小鼠潜伏期的影响，#ρ〈0. 05, #ρ〈0. 01表 明与生理盐水组存在显着性差异。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。
[0029] 实施例1重组高密度脂蛋白表征
[0030] ⑴制备
[0031] 脂质(磷脂酰胆碱+/_神经节苷脂+/_胆固醇+/_胆固醇油酸酯）（2-10mg)溶于 氯仿中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加 PH7. 4磷酸盐缓冲液水化，50°C超声均质。加 入0. 5-5mg的ApoE3,继续超声50min。产品冷却至室温，孵育过夜，4°C保存备用。
[0032] (2)表征
[0033] 重组高密度脂蛋白磷钨酸负染，透射电镜观察形态。激光粒度仪测定其粒径和表 面电位。重组高密度脂蛋白成分分析：荧光分光光度计测定包载荧光探针量；HPLC测定包 载药量；磷脂试剂盒（Phospholipids C assay kit)测定磷脂含量；Bradford法测定蛋白 含量，计算Ap〇E3组装效率。
[0034] 透射电镜结果如图1所示，不含胆固醇油酸酯的重组高密度脂蛋白呈规则扁平的 圆盘状，多个叠加呈蚕茧状，膜结构清晰可见，粒径均一，小于20nM，与天然初生HDL形态相 似（图1A);而含胆固醇油酸酯的重组高密度脂蛋白呈粒径均一的圆球形，粒径15-20nm，与 天然成熟HDL形态相似（图1B)。
[0035] 实施例2重组高密度脂蛋白结合Α β _单体、寡聚体
[0036] ⑴制备
[0037] 称取豆磷脂、蛋磷脂（2-10mg)和0. 02mg荧光探针Dil放入圆底烧瓶中，加入氯 仿溶解，置于旋转蒸发仪20°C，避光真空lh除去有机溶剂。在圆底烧瓶中加入PBS溶液， 37°C振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，40°C超声减小粒径，加入ApoE或ApoE模拟肽 (0· l-10mg)，37°C孵育 36h，4°C保存。
[0038] (2)重组高密度脂蛋白与Αβ _单体、寡聚体的体外吸附结合实验
[0039] 将Α β _单体(浓度为500 μ g/ml)或寡聚体(浓度为500 μ g/ml)的0· 05ΜρΗ9· 6 的碳酸钠-碳酸氢钠溶液加入到板孔中，每孔50μ 1，4°C孵育过夜。弃去孔内孵育液，将孵 育过夜的板用封闭液（〇. 01M PBS，pH 7. 4中含1%BSA，0. 05%Tween-20)封闭lh，然后将荧光 标记的重组高密度脂蛋白1〇μ g/ml，50y g/ml，250y g/ml (按照磷脂量计算)分别加入到板 孔中，37°C孵育过夜，PBS洗三遍，多功能酶标仪荧光检测，Aem/ex为522nm/568nm。结果如 图2所示，重组高密度脂蛋白与Α β η。单体的结合荧光值在10 μ g/ml，50 μ g/ml，250 μ g/ ml时分别为对照脂质体的1. 94倍，1. 26倍和1. 48倍；与Aβ 寡聚体的结合荧光值在 10 μ g/ml，50 μ g/ml，250 μ g/ml时分别为对照脂质体的1. 88倍，1. 71倍和1. 59倍，存在显 着性差异。表明重组高密度脂蛋白具有较强的Αβ结合能力。
[0040] 实施例3重组高密度脂蛋白的Α β亲合特性
[0041] (1)制备
[0042] 称取磷脂酰胆碱、磷脂酸（2-10mg)放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，置于旋转蒸 发仪减压除去有机溶剂。在圆底烧瓶中加入PBS溶液，37°C振摇至瓶内壁脂质膜全部水化 脱落，40°C均质减小粒径，加入ApoE或ApoA-I (0· l-10mg)，37°C孵育36h，4°C保存。
[0043] (2)表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)实验验证重组高密度脂 蛋白的Αβ亲合特性。
[0044] CM5芯片采用氨基偶联的方式将Αβ单体或者寡聚体固定：在用0. 2MEDC和0. 05Μ NHS对芯片表面进行活化后，将Α β单体或者寡聚体稀释于ρΗ4. 0醋酸钠缓冲溶液中，使 Α β浓度为23 μ Μ，以30 μ Ι/min的速度注入420s，再用ρΗ8. 5的乙醇胺进行封闭。参比通 道活化后直接用乙醇胺封闭。亲和力测试采用双信道模式检测：重组高密度脂蛋白稀释于 pH 7. 410mM PBS中，以30μ1/π?η的速度注入到参比通道以及固定了 Αβ的通道。接触时 间为 100s 或 300s，解离时间为 400s。结果用 Biacore Τ200 Evaluation Softeware 程序 进行分析，运用1:1结合模型计算亲和力值。结果显示，重组高密度脂蛋白与Α β i_42单体 (monomer)、寡聚体（oligomer)均呈高亲和力结合（图3)，动态法计算其与Αβ卜 42单体、寡 聚体的亲和力常数KD值，分别为5· 79ηΜ和6· 32ηΜ (与抗原、抗体亲和力同一数量级)，与天 然HDL与Αβ的亲和力（5. 7ηΜ)相似，表明重组高密度脂蛋白具有良好的Αβ亲和特性。
[0045] 实施例4重组高密度脂蛋白抑制Αβ寡聚体、纤丝形成
[0046] (1)制备
[0047] 称取2-10mg磷脂酰胆碱+/_鞘磷脂放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，旋转蒸发除 去有机溶剂。加入Tris缓冲液，37°C振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，超声减小粒径。加 入适量0. 2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37°C 50rpm孵育36h，4°C保存。
[0048] (2)点印记考察重组高密度脂蛋白对Α β η。寡聚体形成的影响
[0049] 取5 μ 1 10mg/ml Αβ ^DMSO储备液3份分别加入以下溶液45 μ 1 :0· 01MPBS、 5〇1^/11114?成3溶液、重组高密度脂蛋白溶液(含4?成3 5〇1^/1111，脂质25〇1^/1111)。置于 恒温空气摇床400rpm，22°C，孵育48h，立即上样。Αβ寡聚体的特异性抗体All和Αβ特异 性抗体6Ε10分别对Α β _寡聚体和总Α β _免疫组化染色。结果如图4所示，ΑροΕ3溶液 和重组高密度脂蛋白均能抑制Α β 寡聚体形成。
[0050] (3)硫磺素 T(ThT)荧光法考察重组高密度脂蛋白对Αβ _纤丝形成的影响
[0051] 取15 μ 1 lmg/ml Αβ _六氟异丙醇储备液，氮吹仪上氮气轻柔吹15min，挥干六 氟异丙醇，加入34 μ 1三蒸水，混勻，再分别加入16 μ 1以下溶液：ApoE3溶液（50 μ g/ml)、 重组高密度脂蛋白溶液(含Ap〇E3 50 μ g/ml，脂质250 μ g/ml )，37°C孵育，并于0h，120h，取 出样品进行ThT检测。结果如图5所示，重组高密度脂蛋白显着抑制A β 纤丝形成。
[0052] 实施例5重组高密度脂蛋白注射给药促进AD模型动物脑内Α β清除，减少小胶质 细胞激活
[0053] ⑴制备
[0054] 称取2-10mg磷脂酰胆碱+/_鞘磷脂放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，旋转蒸发除 去有机溶剂。加入Tris缓冲液，37°C振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，超声减小粒径。加 入适量0. 2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37°C 50rpm孵育36h，4°C保存。
[0055] (2)重组高密度脂蛋白促进AD模型动物SAMP8小鼠的脑内Α β清除，减少小胶质 细胞激活。
[0056] 将10月龄AD模型小鼠 SAMP8小鼠分为生理盐水组、重组高密度脂蛋白组。SAMR 小鼠作为正常对照，给予生理盐水。静脉注射给药，连续给药2周。给药结束后，小鼠水合 氯醛麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4%多聚甲醛溶液继 续固定，浸蜡，包埋，切片，厚度4 μ m，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内Α β聚集体免 疫组化(一抗6Ε10)，小胶质细胞激活(一抗anti-⑶45)。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封 片观察并计数不同处理组动物大脑皮层、海马的Αβ沉积和小胶质细胞激活情况。
[0057] 结果如图6所示，10月龄SAMP8小鼠连续15天尾静脉给予重组高密度脂蛋白 (20mg/kg)，脑内Αβ沉积和小胶质细胞激活情况明显少于生理盐水组。表明重组高密度脂 蛋白能有效促进脑内Αβ清除，并降低脑内炎症，具有一定的AD疾病修饰作用。
[0058] 实施例6重组高密度脂蛋白鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用
[0059] ⑴制备
[0060] 脂质（D0TAP/D0PE+/-DMPC+/-PEG-DMPC) (2-10mg)溶于一定比例氯仿溶液中，减 压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加含siRNA/MicroRNA (1-500 μ g)的Tris缓冲液水化，均质 减小粒径。取lml ApoE3/ApoA I模拟肽（0.5-5mg/ml)10min内加入，超声50min，继续孵 育24h，4°C保存。
[0061] (2)重组高密度脂蛋白鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用
[0062] 将7月龄AD模型小鼠 APP/PS1转基因小鼠分为生理盐水组、重组高密度脂蛋白 组。野生型B6小鼠作为正常对照，给予生理盐水。鼻腔给药4周。给药结束后，小鼠水合氯 醛麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4%多聚甲醛溶液继续 固定，浸蜡，包埋，切片，厚度4 μ m，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内Α β聚集体免疫 组化(一抗6Ε10)，小胶质细胞激活(一抗anti-CD45)。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片 观察并计数不同处理组动物大脑皮层、海马的Α β沉积和小胶质细胞激活情况。结果显示， 7月龄APP/PS1转基因小鼠连续4周鼻腔给予重组高密度脂蛋白，脑内Α β沉积和小胶质细 胞激活情况明显少于生理盐水组，表明重组高密度脂蛋白具有良好的AD疾病修饰作用。
[0063] 实施例7重组高密度脂蛋白与载带药物协同改善AD模型动物的空间学习记忆能 力
[0064] ⑴制备
[0065] 脂质（DMPC/DMPE+/-GM1+/-胆固醇+/_胆固醇油酸酯）（2-10mg)、药物α -倒捻 子素（0. l-2mg)溶于一定比例氯仿-甲醇混合溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加 lml Tris缓冲液水化，50°C超声减小粒径。取lml ApoE3 (0.5-5mg/ml)10min内加入，继 续超声50min。产品冷却至室温，4°C过夜。
[0066] (2)重组高密度脂蛋白与载带药物协同改善AD模型动物的空间学习记忆能力
[0067] 采用Morris水迷宫实验考察重组高密度脂蛋白和载多酚类药物α -倒捻子素的 重组高密度脂蛋白对AD模型动物的空间学习记忆能力的改善作用。给药方法：将7月龄 AD模型动物SAMP8小鼠分为生理盐水组，重组高密度脂蛋白（5mg/kg)，载α -倒捻子素的 重组高密度脂蛋白（相当于给予α-倒捻子素 lmg/kg)。SAMR小鼠作为正常对照，给予生 理盐水。小鼠按照0. lml/10g尾静脉注射给药，连续给药4周。
[0068] Morris水迷宫，水池直径120cm，高50cm，水深25cm，水温22± 1°C。沿水池圆周等 分为四个入水点，它们的连接线将圆形水池等分为I、II、III、IV共4个象限区域，在I象限 中心放置一个9cm黑色平台。平台低于水面约lcm。水池底、平台及四壁均以食用染料涂 成黑色使平台不可见。采用Morris水迷宫视频分析系统2. 0监测并记录小鼠的游泳轨迹。 定位航行试验（Hidden platform test):用于训练和测量小鼠的空间学习能力，与小鼠连 续给药4周后休息2天开始，历时5天。将平台固定于I象限中央，按照随机的原则分别从 I、II、III、IV象限的入水点将小鼠面向池壁放入水中，计算机监测并记录小鼠从入水开始 寻找至找到并爬上黑色平台的路线、所需时间(潜伏期）及游泳速度等。如果小鼠60s内未 找到平台，需将其引领到平台，并停留30s，这时潜伏期记为60s。每天训练4次/只，每次 训练间隔30s。
[0069] 结果如图7所示，正常对照小鼠 SAMR组自第一天训练的后面两次就能比其它实 验组动物更快地找到平台，整个实验过程中的潜伏期都比较短，且随着训练天数增加呈逐 渐缩短的趋势，显示良好的空间学习记忆能力；相反，给予生理盐水的SAMP8小鼠直至第五 天潜伏期依然很长（55. 7±6. 3s)，表现为明显的学习记忆障碍。给予重组高密度脂蛋白 的SAMP8小鼠在训练前三天潜伏期明显缩短趋势，第三天潜伏期已与生理盐水组存在显着 性差异，表明给予重组高密度脂蛋白能够有效提高SAMP8小鼠的空间学习记忆能力。给予 倒捻子素的重组高密度脂蛋白更有效地缩短小鼠上台前潜伏期，训练第四天、第五天的 潜伏期分别为37. 5±6.0s，35. 9± 18. ls，与生理盐水组存在显着性差异，表明载药重组高 密度脂蛋白可能通过重组高密度脂蛋白和多酚类药物的协同作用进一步增强对AD的疾病 修饰作用。
[0070] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成。
3. 据权利要求2所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物 中的应用，其特征在于，所述脂质通过常规方法制备脂质体，而后与载脂蛋白共同孵育，通 过自组装形成重组高密度脂蛋白，脂质质量占处方含量的20-95%，载脂蛋白质量占处方含 量的5-80%。
4. 根据权利要求2或3所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海 默病药物中的应用，其特征在于，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ApoA-I及其模拟肽、 ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。
5. 根据权利要求4所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽中的一种或多种。
6. 根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白采用注射途径给药或者鼻腔途径给 药。
7. 根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为l_500nm。
8. 根据权利要求7所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为5-50nm。
9. 根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白分散在药剂学上可以接受的缓冲溶 液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。
10. 根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病 药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白包载药物起协同防治阿尔茨海默 病的作用，所述药物是指治疗或诊断阿尔茨海默病的药物，包括小分子化学药物，大分子多 肽、蛋白、基因药物中的一种或者多种。
【文档编号】A61P25/28GK104138595SQ201310164937
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】高小玲, 陈红专, 宋清香, 黄萌, 王小林 申请人:上海交通大学医学院