一种基于TALENs基因编辑花生育种方法与流程

本发明涉及一种基于talens基因编辑花生育种方法，属于农业生物工程
技术领域：
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背景技术：
：花生又名落花生，属一年生草本植物，是我国重要的油料和经济作物。我国的花生种植面积和生产总量均居世界前列在国际上具有很强的竞争力。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，因为油酸具有较好的氧化稳定性，从而减少脂质氧化，从而解决花生制品在生产和储存期间由于脂质氧化而产生的不良的气味、口味及货架期缩短等问题。油酸还是一种单不饱和脂肪酸能降低身体低密度脂蛋白(ldl)水平，维持高密度脂蛋白(hdl)水平。所以高油酸花生不仅可以有效延长花生制品的保质期和货架期，同时也有益于人们的身体健康。选育高油酸花生新品种是花生育种的重要目标之一。目前已知fad2(δ12脂肪酸脱氢酶)是脂肪酸生物合成途径中催化油酸在第12碳位脱氢，形成双键向亚油酸基转变的关键酶。传统育种思路是通过自然突变体(如美国筛选出来的f435)或者通过诱变筛选出来的高油酸突变体进行杂变，回交改良，这些育种方法都存大育种效率低，时间较长等缺点。花生是异源四倍体植物，高油酸花生中fad2a基因起始密码子后448bp处g:c→a：t的替换使得d150n氨基酸的变异，fad2b基因起始密码子后442bp处a插入，使得终止密码子提前出现，从而使得fad2基因的表达降低或功能丧失。传统的杂交育种方法需要很难做到精准突变，并且费时费力。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高花生油酸的基于talens基因编辑花生育种方法。实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种基于talens基因编辑花生育种方法，包括以下步骤：1)talens左右臂序列的设计：分析花生品种的fad2基因的序列，并设计左右臂序列；2)组装至表达载体：将步骤1)得到的左右臂序列组装至植物表达载体并转染农杆菌，得到含有转化质粒的农杆菌；3)遗传转化：将步骤2)得到的含有转化质粒的农杆菌遗传转化至花生种子；4)选育：根据目标性状选育。作为优选，步骤1)中，所述左右臂序列中左臂序列为seqidno.1，右臂序列为seqidno.2。作为优选，步骤1)中，所述左右臂序列中左臂序列为seqidno.3，右臂序列为seqidno.4。作为优选，步骤2)中，所述表达载体为pcambia3301或pcambia1301。作为优选，步骤3)中，遗传转化的具体操作为：a)用花生种子制作外植体；b)将含有转化质粒的农杆菌接种至yep培养基培养，收集菌体，将菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体ms培养基中，得到侵染液；c)将外植体浸浮于侵染液，共培养，得到共培养后外植体。作为优选，步骤c)中，共培养前，向侵染液加入0.1wt％的silweetl-77。作为优选，步骤4)中，所述目标性状为油酸含量大于60％。本发明的配方设计原理如下：本发明将已经发布花生的fad2基因序列在ncbi数据库和花生野生种基因库进行比较，为了使得fad2基因失去功能，同时避开fad2a和fad2b的snp位点，在fad2基因序列的起始密码子附近，共设计以下几条左右两臂的识别序列，通过两两组合的方式找到最佳的基因编辑。其中，其中l1r1的间隔距离为13bp,l1r2的间隔距离为14bp，l2r1的间隔距离为16bp,l2r2的间隔距离为17bp,l3r1的间隔距离为14bp,l3r2的间隔距离为15bp。本发明将已经发布花生的fad2基因序列在ncbi数据库和花生野生种基因库进行比较，为了使得fad2基因失去功能，同时避开fad2a和fad2b的snp位点，在fad2基因序列的起始密码子附近，共设计以下几条左右两臂的识别序列，通过两两组合的方式找到最佳的基因编辑。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种能有效提高花生油酸含量的基因编辑方法，该高油酸含量的性状可稳定地遗传至子代。附图说明图1为l1r1为载体编辑粤油7号的t0代种子油酸含量。图2为l2r2为载体编辑粤油7号的t0代种子油酸含量。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：实施例1：talens左右臂基因的设计本发明将已经发布花生的fad2基因序列在ncbi数据库和花生野生种基因库进行比较，为了使得fad2基因失去功能，同时避开fad2a和fad2b的snp位点，在fad2基因序列的起始密码子附近，共设计以下三条左臂基因和两条右臂的识别序列，如seqidno.1所示的l1、如seqidno.3所示的l2、如seqidno.5所示的l3，如seqidno.2所示的r1和如seqidno.4所示的r2。l1：caaaagaagcctctttl2：gaagctcaaaagaagcctcl3：caaaagaagcctcttr1：ttcaaaccctccattcr2：tcaaaccctccattc再通过两两组合的方式找到最佳的基因编辑。其l1和r1组合成l1r1的间隔距离为13bp，l1和r2组合成l1r2的间隔距离为14bp，l2和r1组合成l2r1的间隔距离为16bp，l2和r2组合成l2r2的间隔距离为17bp，l3和r1的组合的成l3r1的间隔距离为14bp，l3和r2组合成l3r2的间隔距离为15bp。实施例2：克隆至表达载体通过斯丹赛公司的talenkit试剂盒，将实施例1得到的talens左右臂序列l1r1、l1r2、l2r1、l3r1和l3r2分别进行组装，再分别亚克隆至植物表达载体，并转染农杆菌，挑选阳性菌种，得到含有转化质粒的农杆菌。实施例3：遗传转化a)用花生种子制作外植体：取粤油7号花生种子，对花生种子进行编号，设置对照组编号为wt，将花生种子去壳，用蒸馏水冲洗，再在蒸馏水中浸泡30-60分钟；然后消毒，去种皮，沿子叶间缝隙切开种子，取含胚的半粒种子，再沿胚的子叶节点切去胚芽，得到待转化的外植体；b)将实施例2)得到的含有待转化质粒的农杆菌接种至yep液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将yep液体培养液离心收集农杆菌菌体，并将农杆菌菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体ms培养基中，得到侵染液；c)将步骤a)得到的待转化的外植体浸浮于步骤b)得到的侵染液中，加入0.1wt％的silweetl-77，侵染10-20分钟，然后将外植体和侵染液在真空条件下静置10-20分钟；取出外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基中，黑暗培养2-3天；再在光照16h/d的条件下培养7-10天，得到共培养后的外植体；共培养后的外植体的识别区的序列的变化情况下表所示，表1l1r1编辑种子识别区的序列变化情况表2l2r2编辑种子识别区的序列变化情况d)将共培养后的外植体移至灭菌砂土中，培养驯化后，移入温室中繁殖。实施例4：油酸检测收获实施例3外植体的t0代种子，检测实施例3得到的外植体种子的油酸含量，大于60％的视为阳性株。各talens左右臂的转化株数、阳性株数和频率统计如下表所示：表3选育结果统计利用非破损型红外检测仪对t0代种子进行油酸含量检测，结果图1和2所示，通过l1r1和l2r2进行编辑fad2基因均可得到高油酸的花生，其中，l2r2的转化率较l1r1要高，这可能与左右臂的间隔距离有关，在花生中，左右臂间隔距离在14-16bp的距离是不利于剪切酶形成二聚体结构，从而无法编辑花生的fad2基因，而间隔距离为17bp的l2r2的效果比间隔距离为13bp的l1r1要好，其中，314号油酸含量高达90％。实施例5：选育将实施例4检测到的油酸含量高于60％的t0代种子进行种植，得到t1代种子，利用非破损型的近红外检测仪进行油酸含量的检测分析结果如下：表4t1代种子油酸含量由上表的结果可知，t1代种子的油酸含量与t0代相比，并未降低，甚至还要高于t0代种子，说明，经过本发明提供的方法进行的育种，其高油酸含量的性状可稳定地遗传。实施例6：验证将实施例2得到的含有l1r1左右臂序列的转化质粒的农杆菌以及含有l2r2左右臂序列的转化质粒。对粤油13号花生种子进行基因编辑操作，其t0代种子油酸含量下表所示：表5粤油13号t0代种子油酸含量样品号左右臂序列对油酸[％]wt无30.941l1r162.785l1r163.318l1r172.9112l1r161.0811l1r169.1913l1r167.2821l2r271.9899l2r262.31将t0代种子进行遗传育种，得到t1代种子，其油酸含量如下表所示：表6粤油13t1代种子油酸含量样品号油酸[％]样品号油酸[％]样品号油酸[％]样品号油酸[％]1－163.218－172.2111－270.3213－366.831－262.328－272.3311－369.3221－169.781－363.248－372.3511－468.8921－268.981－462.8712－160.9211－571.2399－164.225－163.1112－261.3211－669.2299－263.785－263.4212－362.2113－166.2399－363.235－363.2311－170.1213－267.3499－462.43将t1代种子编号8的株系进行进一步的跟踪检测，其t2代种子进行近红外光谱仪的检测结果如下表所示：表7粤油13t2代种子油酸含量样品号油酸[％]样品号油酸[％]样品号油酸[％]样品号油酸[％]8－1－172.238－1－771.768－2－670.828－3－371.208－1－271.988－1－871.898－2－771.108－3－471.108－1－372.328－2－172.138－2－873.198－3－570.988－1－472.428－2－372.338－2－972.318－3－671.348－1－573.118－2－472.118－3－172.248－3－769.688－1－672.458－2－572.148－3－272.438－3－870.88由以上验证试验可知，l1r1或l2r2作为talens左右臂序列，其能使花生种子的油酸含量大幅增高，且该高油酸性状具有较好的遗传稳定性。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。sequencelisting<110>广东省农业科学院作物研究所<120>一种基于talens基因编辑花生育种方法<130>一种基于talens基因编辑花生育种方法<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<400>1caaaagaagcctcttt16<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列<400>2ttcaaaccctccattc16<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3gaagctcaaaagaagcctc19<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4tcaaaccctccattc15<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列<400>5caaaagaagcctctt15当前第1页12