一种分蘖洋葱快速繁殖方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于农业技术领域，具体设及一种分葉洋葱快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 植物组织培养技术是W植物生理学为基础发展起来的一口新兴技术，是指在无菌 条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体在人工配制的培养基上，给予适宜的条件 进行培养，诱导产生愈伤组织或不定芽等，或者长成完整植株的过程。该技术自20世纪初 建立W来，在理论研究和应用技术上不断发展，已广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良、 基因工程育种、种质资源保存、次生代谢产物生产等方面，产生了巨大的经济效益和社会效 益，对现代农业和医药等领域产生了深刻影响。
[0003] 百合科葱属植物在生产上多采用葉生小鱗茎进行繁殖，繁殖系数较低。而且其鱗 茎属于短缩茎，快速繁育体系的建立存在一定的困难。目前关于分葉洋葱快繁的相关报道 并不多见，徐启江剥取0.3-0.5mm茎尖进行诱导，再经启动培养、生根培养即可获得分葉洋 葱茎尖脱毒苗。姜玉东认为多效挫具有很强的促进试管鱗茎形成的作用。陈典和徐启江W 分葉洋葱茎尖为外植体经不同发生途径获得再生植株，其中，W分葉洋葱茎尖为外植体经 器官发生途径获得试管苗。王勇、刘照坤、相元萍等均尝试通过愈伤组织诱导及再分化途径 获得分葉洋葱再生植株，但分化率不高，且通过愈伤组织培养，很容易产生变异，难W实现 分葉洋葱的工厂化生产。分葉洋葱的组培快繁能够实现其在短时间内的快速增殖，但是增 殖率的高低一直是限制分葉洋葱进行工厂化生产的瓶颈，因此发明一种分葉洋葱快速繁殖 的方法是解决上述问题的有效途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决为了解决分葉洋葱组培快繁增殖率不高，难W满足大规 模生产的问题，而提供一种分葉洋葱鱗茎盘快速繁殖方法。
[000引1)取分葉洋葱鱗茎，去除分葉洋葱鱗茎盘木栓化的部位，剥除外层鱗片，保留W中 屯、生长点为中屯、，直径为0.4-lcm的鱗茎盘及其上部包裹的鱗片，获得葱属植物的中屯、部 位；清洗、消毒； 2) 在中屯、部位距底端3-5mm处横切后去除上部鱗片，沿主生长点垂直切线纵向分割成 4份，去除主生长点及主生长点所在的鱗茎盘，接种于PH 5.8，MS+6-BA 0.2-0.8mg/L、NAA 0.05-0.15mg/L培养基中培养，诱导丛生芽； 3) 继续培养成苗； 所述的6-BA 0.6-0.8mg/L、NAA O.lmg/L; 所述的切割成4份是W主生长点两条垂直的切线为切口，进行切割，切成4份，其中只有 一个1/4份切块带有主生长点鱗茎盘，剥掉主生长点和主生长点所在的鱗茎盘； 所述的1/4份鱗茎盘上部的鱗茎基部需要再进行切割，至远主生长点端高，近主生长点 端低的斜面； 所述的分葉洋葱鱗茎为实验室试管微鱗茎盘； 所述的试管苗微鱗茎为试管苗经结球培养基诱导培养6周或直径达到8mmW上的； 所述的试管苗包括无毒试管苗及脱毒试管苗； 所述的脱毒试管苗是取分葉洋葱茎尖部位，清洗、消毒，剥离分葉洋葱茎尖生长点< 0.3mm部分，在启动培养基中诱导成苗;经鉴定无毒后挑选出的试管苗。
[0006] 本发明提供了一种分葉洋葱鱗茎盘快速繁殖方法，将分葉洋葱中屯、部位清洗、消 毒，去除上部鱗茎，保留包含主生长点在内的鱗茎盘，去除主生长点及主生长点鱗茎盘，诱 导丛生芽，并培养成苗，通过上述培养过程的优化建立了分葉洋葱鱗茎盘快速繁殖体系，获 得了大量的无毒试管苗，该体系增殖时间短，增殖系数大，遗传稳定性高，通过该体系能够 实现分葉洋葱的快速繁育，可W为分葉洋葱脱毒种苗的工厂化生产提供低价格成本、低时 间成本的有力保障，为脱毒分葉洋葱产业化奠定基础。
【附图说明】
[0007] 图1不同激素组合对分葉洋葱茎尖增殖的影响(a:分葉洋葱茎尖;b:茎尖在6-BA、 NAA组合中的增殖情况;C:茎尖在6-BA、IAA中的增殖情况）； 图2分葉洋葱鱗茎盘的获得； 图3分葉洋葱试管微鱗茎盘切割步骤流程； 图4分葉洋葱试管微鱗茎盘切割步骤流程示意图； 图5.分葉洋葱试管鱗茎盘增殖(a:分葉洋葱试管微鱗茎盘;b:第2周显微镜下观察到的 增殖情况;C:第3周丛生芽增殖、生长情况;d:第4周丛生芽增殖、生长情况）； 图6.分葉洋葱试管苗壮苗培养(a:分葉洋葱试管增殖丛生苗;b:单株分葉洋葱试管 苗;C:壮苗培养后的试管苗）； 图7茗葱中屯、部位的获得； 图8茗葱鱗茎盘的获得； 图9茗葱鱗茎盘增殖苗的获得； 图10茗葱增殖苗生根； 图11大蒜鱗茎盘的获得； 图12大蒜鱗茎盘接种； 图13大蒜鱗茎盘增殖。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1分葉洋葱茎尖增殖 将分葉洋葱茎尖分别接种于不同浓度的6-BA、NAA组合，6-BAJAA组合培养基中（表1)， 两种激素组合均能够获得分葉洋葱试管增殖苗，但相同浓度的IAA和NAA在进行增殖诱导 时，差异很大。其中在6-BA、NAA激素组合中诱导的增殖苗长势较好，且分化系数较高，在培 养4周时，平均增殖系数可达3.87; 6-BA、IAA激素组合虽然也能够实现茎尖增殖，但所获得 的增殖苗细、弱，分化系数低，且有白化苗出现(如图1)。可见，IAA的作用效果不如NAA。因 此确定MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1 mg/L培养基为茎尖增殖最佳培养基。
[0009]
注:MS为基础培养基。
[0010] 实施例2分葉洋葱鱗茎盘增殖 取分葉洋葱一枚，去除分葉洋葱鱗茎盘木栓化的部位，保留W中屯、生长点为中屯、，直径 为0.4-lcm的鱗茎盘及其上部包裹的鱗茎，得到分葉洋葱中屯、部位。将分葉洋葱中屯、部位用 流水冲洗0.5 h，用75%酒精浸泡消毒1 min后，随后用1%化αο溶液浸泡消毒15-20 min， 无菌水冲洗3-5次W清除残余的NaClO,用滤纸吸干水分备用(如图2)。
[0011] 然后去除上部鱗茎，保留包含主生长点在内的鱗茎盘，将鱗茎盘切割成4份后去除 主生长点及主生长点鱗茎盘，分别接种于WMS为基础培养基，添加6-BA(0.2-0.8 mg/L)、 NAA(0.1 -2. Omg/L)，PH调节至5.8的增值培养基中培养，诱导丛生芽。在25 °C、光照时间为 1611、光照强度为2500111^条件下，经过4周的诱导，^6-134、酷4组合诱导效果最好;6-134、1八八 组合也能诱导出丛生芽，但增殖系数低，再生苗存在崎形苗。其中鱗茎盘在添加6-BA0.6mg/ L、NAA0.1mg/L的培养基中，4周后，分化数达到最大值，每个鱗茎盘最大增殖系数(增殖系数 =分化芽总数/接种数)可达20(见表2)。随着诱导时间的增加，鱗茎盘分化数增加，但在诱导 第4周后鱗茎盘分化数不再增加，鱗茎盘的分化率达最大值(见表3)。
[0012]
注:MS为基础培养基。
[0013]
注:MS为基础培养基。
[0014] 实施例3分葉洋葱脱毒苗试管结球 取分葉洋葱茎尖部位，流水冲洗半小时，用75%酒精浸泡消毒Imin后，随后用1%化CIO 溶液浸泡消毒15-20min，无菌水冲洗3-5次W清除残余的化CIO,用滤纸吸干水分备用，显 微镜下剥离分葉洋葱茎尖生长点<0.3mm部分，在WMS为基础培养基，添加6-BA、IAA的启动 培养基中诱导成苗。
[001引茎尖成苗后，分别W薦糖为基础碳源设置30mg/L、45mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/L 共5个碳源糖浓度，探讨不同糖浓度对分葉洋葱试管苗结球的影响，筛选最佳结球培养基中 糖浓度，通过培养发现，随着糖浓度的增加鱗茎结球直径、鲜重增加。当糖浓度高于75 mg/L 时，结球速度加快但影响根的生长，导致最终鱗茎平均直径、鲜重降低(见表4)。
[0016] 在脱毒苗结球培养过程中，通过对培养昼夜溫差的调控，调节试管苗的结球速度， 针对分葉洋葱生长的适宜溫度分别设置25"C/25°C、25°C/20°C、25°C/15°C共3组昼夜溫度 处理，筛选最佳培养溫度。在昼夜溫差为l〇°C时鱗茎直径和鱗茎鲜重要优于其他处理。由此 确定在分葉洋葱脱毒苗结球过程中，最佳培养溫度为白天25°C，夜间15°C(见表5)。
[0017] 在脱毒苗结球培养过程中，通过对培养过程中的光照强度、光周期的调控，调节试 管苗的结球速度，针对分葉洋葱生长条件分别设置3组光照强度、光周期处理。结果表明，随 光照强度和光照时间的延长，试管球的平均直径和鱗茎鲜重逐步增加，在光照强度为 25001ux，l化光照、她黑暗条件时有利于分葉洋葱脱毒试管苗结球，其试管球鱗茎平均直 径、鱗茎鲜重均高于其他培养条件(表6)。
[0018] 通过结球条件的优化建立了高效的分葉洋葱脱毒苗试管鱗茎诱导体系，为分葉洋 葱脱毒种苗的快速繁育提供了有利保障。
[0019]
[0021]
注:MS为基础培养基。
[0022] 实施例4利用试管微鱗茎盘增殖技术建立分葉洋葱脱毒种苗快繁体系 (1)试管微鱗茎盘的获得 分葉洋葱试管苗经过结球培养6周后或分葉洋葱试管球直径达到8mm W上时，可切取试