专利名称：一种鱼类转基因育种的方法
技术领域：
一种鱼类转基因育种的方法，属于分子生物学鱼类育种技术领域。本发明
主要将某种鱼类本身的基因组DNA经过预处理，获得有别于原基因组DNA的 DNA重排片断，用转基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中， 和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从 中可以筛选优良的个体，进行进一步选育。并用目标区域扩增多态性(TRAP) 方法判断DNA重排片断是否进入基因组，用两步扩增法获得变异的基因。为以 后进行功能基因组5开究提供一个基础，同时获得独特的分子标记。
背景技术：
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达， 引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。由于生物组 织的复杂性，导入的基因序列会遇到很多问题，如整合，表达，基因沉默等， 更重要的是这些基因在生物体中到底有什么功能，以及它们的调控机制很难完 全搞明白，因此很难得到预期的结果。也就是说尽管导入的是已知序列的基因 也难预知结果如何。
异源总DNA导入动植物以获得具有新性状的品系是一种在实践上很有效的 方法。通过该方法获得新的品系的种类最近几年在中国有报道的在植物方面有 小麦，玉米，水稻，马铃薯等。在动物方面也有一定的应用，如中科院水生 所刘汉勤等人采用精子载体的方法将鲫鱼肝总DNA转入红鲤体内，后代中有 0.69%的个体体色中产生了鲫鱼黑色素。1997年章怀云等人将草鱼精子与红鲤 鱼肝脏总DNA共培养，获得了体形、体色变异的个体。
和转特定基因相比，异源总DNA导入动植物可以获得大量形态各异的突变 体，可供研究者进行下一步选育。而且由于大部分真核生物的基因组有大量的 非编码序列，这些序列的功能如何我们并不知道，而异源总DNA导入法对这些 非编码区域的序列也进行了筛选。但前提就是要知道哪些序列进入了基因组。 通过RAPD和Southem杂交人们找到一些区别于宿主的条带，但是都没有进一步 的研究报道，很难让人相信这些条带是否一定是导入的外源序列，因此这个方 法受到广泛的质疑。
关于该异源总DNA导入方法的理论基础，1974年周光宇提出了染色体水平 以下的DNA片段杂交假说，认为异源总DNA导入导致的外型变化是在母本染色 体基础上添加了交换的远缘DNA片段的结果。这一假设为高粱稻及其亲本的同工酶酶谱分析及DNA杂交的复性动力学初步证实。但是由于没有合适的技术跟 踪这些外源DNA，所以以上假设没有最直接的证明。
异源总DNA导入鱼类最难解决的问题就是如何跟踪进入细胞核的外源序 列。由于大部分外源DNA片断进入基因组最终是被降解的，但具体过程并没有 深入研究的报道。所以我们必须找到一个方法可以降低导入外源DNA的降解。 根据这几年转基因研究的结论，越接近宿主序列的基因越倾向于保留。所以我 们设想如果将鱼类本身的基因组片断改变次序再导入原种鱼类的卵细胞，研究 其是否能被保留，并对原基因组产生影响，产生突变型。
发明内容
本发明目的在于提供一个新的方法和思路，利用鱼类本身的基因组DNA， 经过预处理，形成新的DNA片断(DNA重排序列)，同时利用设计好的接头作为 跟踪序列，利用转基因的方法导入原种鱼类，对基因组进行干扰，形成变异基 因和外形上的变化，同时设计两步扩增法获得DNA重排序列，以解决以往外源 总DNA导入法所无法了解的哪些序列进入宿主导致突变型的产生。
本发明还涉及一种简单的获得鱼类突变体的方法。
本发明还涉及鱼类育种中获得新选育突变个体的方法。
本发明还涉及很多功能序列的寻找。
本发明还涉及获得的鱼类新品系的相关分子标记的获得。
本发明的技术方案 一种鱼类转基因育种的方法，将某种鱼类本身的基因 组DNA经过预处理，成为一种有别于原基因组DNA的DNA重排片断，用转 基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发 生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中筛选生产性状优良的 个体，进行进一步选育；
通过设计好的扩增固定引物gmprimer 2对这些突变个体基因组进行扩增， 用目标区域扩增多态性TRAP方法判断DNA重排片断是否进入突变个体的基因 组，设计两个引物gmprimerl和gmprimerl+l:用两步扩增法获得变异的基因， 作为鉴定这些突变个体的分子标记；
所述某种鱼类本身的基因组DNA预处理方法
提取某种鱼类的基因组DNA，先用限制性内切酶^fe^I酶切反应，反应完 成后用反应体系2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，重新连接， 连接反应结束后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，再用限制 性内切酶五co及I酶切，用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后， 加入跟踪接头序列gmadaptorl连接，用2倍体积的乙醇沉淀，保存。
基因组DNA预处理方法，跟踪接头序列为gmadaptorl: cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgct。TRAP的扩增固定引物为gmprimer2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct。 为得到用两步扩增法获得变异的基因所设计的两个引物为 gmprimer 1: actcatgatc etcgtagact gcgtacc; gmprimer 1+h atcctcgtag actgcgtacc aattn 。
鱼类本身的基因组DNA预处理方法，其他识别位点为四个碱基的限制性内 切酶都能代替限制性内切酶I用于酶切反应。
本发明的有益效果目前， 一般采用的鱼类转基因育种方法为异源总DNA 导入法，但无法跟踪导入序列，本发明采用将一种鱼类本身的基因组用一种限 制性内切酶切断，重新连接，再换一种限制性内切酶酶切，得到的新片断完全 来自该种鱼类，可以在该种鱼类的基因组中找到同源序列，但由于二次连接后 次序被打乱，又不完全是该种鱼类原来的序列。研究证明这样的序列更容易被 保留，并对该种鱼类的基因组产生影响，产生突变型。经过几年的试验，证明 本方法可行。通过对鲤鱼的研究发现本方法可以获得很多表型发生变化的个体， 图1表示经随机扩增多态性RAPD检测获得不同基因型的个体，同时通过二次 扩增获得导致这些表型变化的序列；图2表示两条体型较小的个体的变异基因 扩增结果。
图1. RAPD引物S68扩增图。1 10是转基因鲤鱼的扩增图谱，11~19是普 通鲤鱼的扩增图谱，所有普通鲤鱼有的基因型，转基因鲤鱼都有，但个体4和 10没有扩增产物，是普通鲤鱼没有的基因型，说明导入序列在宿主基因组发生 作用，形成了新基因型。
图2.用设计好的引物Gmprimer 1 + 1第二步扩增电泳图，control没有扩增 产物，1、 2是转基因小鱼的扩增产物，说明用导入的跟踪序列设计的引物可以 获得导入宿主的序列，测序后可获得特异分子标记。
具体实施例方式
1、基因组DNA提取和DNA重排片断的构建
取鲤鱼(肌肉或者血液)提取基因组DNA (—般是蛋白酶K法提取)。 提取的DNA先用一种限制性内切酶#M I酶切(反应体系150 nL反应总 体积中含l-10ng模板DNA、 2U酶、15 nL10xTango buffer; 37'C酶切16h)， 反应完成后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，用30pL体积 重新连接(反应体系为2.5UT4连接酶、2 pL10xlinkagese buffer; 16'C连接 过夜)，反应结束后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，再用 第二种限制性内切酶&oi I酶切(反应体系为50pL反应总体积中含4U酶、 5 ^L10xTango buffer; 37。C酶切16h)，用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心， 吹干乙醇后，加人10pL的连接混合物(2nL5xlinkagesebuffer、 50pmol设计好的跟踪接头gmadaptor 1和2.5 UT4连接酶)，16'C连接过夜，即得到所称的DNA重排片断，用0.8%的琼脂糖凝胶进行检测后，最后用2倍体积的乙醇沉淀，保存。
2、 将得到的DNA重排片断用精子携带法导入鲤鱼卵中，孵化后获得大量形态变异的个体，如个体大小，长短，颜色，鳞片等。选择一些个体提取基因组DNA。
3、 TRAP (目标区域扩增多态性)检测DNA重排片断是否进入基因组根据跟踪接头序列设计引物gmprimer2作为TRAP (目标区域扩增多态性)
的扩增固定引物，TRAP随机引物共三个Ga5-800 (ggaaccaaacacatgaaga);Ga3誦800(tcateteaaaccatatacac); Odd26誦700 (ctatctctcgggaccaaac)。扩增反应总体积为25^iL，包括1.0nL步骤2中得到的基因组DNA溶液，2.5 10xPCR buffer,5pmo1 TRAP随机引物，5pmo1 gmprimer 2， 1.5 |iLdNTPs (2.5 mmol/L)， 2 U 72^酶，加水至25pL。扩增反应的程序为首先进行94'C变性2min;然后94。C变性30 s， 38。C复性45s, 72。C延伸2min，反应进行5个循环；然后94。C变性30s，55'C复性45s， 72'C延伸2min,反应进行30个循环；最后72"C延伸10 min。在1.0°/0的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。
同时用没有导入DNA重排片断的鲤鱼个体数条作为对照，当对照鲤鱼没有扩增产物或扩增产物不明显，而导入DNA重排片断的变异个体有明显扩增产物，说明DNA重排片断已经进入变异个体基因组。
4、 RAPD (随机扩增多态性)检测基因组CCGG区域的变异，由于我们采用限制性内切酶il^p I酶作为进行第一次酶切，其识别位点为基因组CCGG区域，获得的DNA重排片断发生变化的位点是基因组CCGG区域，所以检测基因组ccgg区域就知道是否有变异基因出现。
引物采用具有ccgg或ggcc的RAPD引物(大部分生物公司均有现成的引物出售)。扩增反应总体积为25 pL，包括1.0pL步骤2中得到的基因组DNA溶液，2.5 pL10xPCR buffer, 5pmolRAPD引物，1.5 pLdNTPs (2.5腿ol/L)， 2UTaq酶，加水至25pL。扩增反应的程序为首先进行94'C变性2min;然后94'C变性30s， 36"C复性45s, 72'C延伸lmin30s，反应进行30个循环；最后72'C延伸10min。在1.0%的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。
用普通鲤鱼数条作为对照，如果在导入DNA重排片断的变异个体中发现普通鲤鱼中没有出^L的扩增结果，说明变异个体中有变异基因的存在。
5、 DNA重排片断的获得，由于基因组DNA经预处理后获得的DNA重排片断是变异基因的所在位置，所以获得DNA重排片断就找到变异基因。
选择用步骤2育种方法得到的发生体型变小的个体，按提取基因组DNA作为模板。DNA重排片断的扩增用两步法得到。第一步:扩增反应总体积为25 ^L,包括1.0nL模板，2.5pL 10xPCR buffer, 5pmol gmprimerl (设计好的第一步扩增引物)，1.5pLdNTPs(2.5mmol/L)， 2UTaq酶，加水至25 pL。扩增反应的程序为首先进行94'C变性2min;然后94'C变性30 s， 55-65X:复性45 s， 72'C延伸2min，反应进行30个循环，最后72'C延伸10 min。第二步扩增反应总体积为25 nL，包括1.0 nL模板，2.5 pL 10xPCR buffer, 5pmo1 gmprimer 1+1(设计好的第二步扩增引物)，1.5 ^LdNTPs(2.5mmol/L)， 2UTaq酶，加水至25pL。扩增反应的程序为首先进行94'C变性2min;然后94'C变性30 s， 55-65。C复性30-150 s， 72'C延伸2min，反应进行30个循环；最后72'C延伸10 min。用1.0 %的琼脂糖电泳(EB染色)检测扩增产物的量；然后特异片段直接从凝胶上切下来，用胶回收试剂盒回收，克隆进pMD-18-T载体，送上海生物工程公司测序。
6、 DNA重排片断的分析
本试验我们在两个转基因变异的小鱼中获得几个DNA重排片断，这些片断就是变异基因所在位置，对这些片断进行了分析，发现它们不编码任何蛋白，和已知的调控序列也没有任何相似性，通过NCBI网站比对我们也未找到任何相近的序列。转基因鱼中得到DNA重排片断为SEQIDNO: 1，下划线处是发生重排的位点。序
列
表
<210> SEQIDNO:l
<211> 909
<212> DNA
<213> 鲤鱼总DNA
<400> 1
cttgcatgcctgcaggtcgacgattatcctcgtagactgcgtaccaattgcctcagtaac60
gcatctaatttaaaaaatgctctatatactcatagacgacgcttttccctctcctattat120
ctaaatctatct^gtttgaaactgtctggccgtctaaattttcagtctaaatctgtct180
ggcttttgaaactgaaaacatttgaattacgaaaaaggcccagatttcatgacacggcct240
caccctgccaacataaeicagcagccttcagcacctagccagtctcaagactgtcaatgca300
cgtstaataagaccgaattaagtetatttaacattagccteiaatctcttttggtatcaacaa360
taettgatgataettaaatacatttatagtatataggctaagtctttagatagtacgatagt420
attccagtagcctatttaattctccatatagcctatctttttcttttttt480
ttttttttttttgtataaacgtttttttaacatcttcttcgagatcttttccattttctg540
cttagtcttttgtatttc犯cagcctctctgtggctttcc鄉C3gtggCatagtgcacc600
accctccttattatcataaggiccaBcggtttaaatcactc660
aaac aac aatcaagatctcacatacctgatggcaatatcctgttgagattgtggacagca720
gtgggttattccatcaagtctgcttccatccgccgtcttcttcctcacccagctgtttta780
ttttttcctataggctctcagcctctccct￡LgCtC￡lgC3Ccaacaatgcaggtggagccc840
cccctggcaagaccattcagactg鄉gagtctggtUtgcagcaattggtacgca,gtcta900
cgaggataa909
gmadaptor 1-
cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgctgmprimer2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct
gmprimerl- actcatgatc ctcgtagact gcgtaccgmprimerl+1- atcctcgtag actgcgtacc aattn
权利要求
1、一种鱼类转基因育种的方法，其特征是将某种鱼类本身的基因组DNA经过预处理，成为一种有别于原基因组DNA的DNA重排片断，用转基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中筛选生产性状优良的个体，进行进一步选育；通过设计好的扩增固定引物gmprimer 2对这些突变个体基因组进行扩增，用目标区域扩增多态性TRAP方法判断DNA重排片断是否进入突变个体的基因组，设计两个引物gmprimer 1和gmprimer 1+1用两步扩增法获得变异的基因，作为鉴定这些突变个体的分子标记；所述某种鱼类本身的基因组DNA预处理方法提取某种鱼类的基因组DNA，先用限制性内切酶Msp I酶切反应，反应完成后用反应体系2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，重新连接，连接反应结束后用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，再用限制性内切酶EcoR I酶切，用2倍体积的乙醇沉淀，12000转离心，吹干乙醇后，加入跟踪接头序列gmadaptor 1连接，用2倍体积的乙醇沉淀，保存。
2、 根据权利要求1所述的一种鱼类转基因育种的方法，其特征是鱼类本身 的基因组DNA预处理方法，跟踪接头序列为gmadaptor 1:cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgct。
3、 根据权利要求1所述的一种鱼类转基因育种的方法，其特征是， TRAP的扩增固定引物为gmprimer 2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct。
4、 根据权利要求1所述的一种鱼类转基因育种的方法，其特征是，为得到 用两步扩增法获得变异的基因所设计的两个引物为gmprimer 1 - actcatgatc ctcgtagact gcgtacc-gmprimer 1+1: atcctcgtag actgcgtacc aattn。
5、 根据权利要求1所述的一种鱼类转基因育种的方法，其特征是，鱼类本 身的基因组DNA预处理方法，其他识别位点为四个碱基的限制性内切酶都能代 替限制性内切 酶I用于酶切反应。
全文摘要
一种鱼类转基因育种的方法，属于分子生物学鱼类育种技术领域。本发明主要将某种鱼类本身的基因组DNA经过预处理，获得有别于原基因组DNA的DNA重排片断，用转基因的方法将DNA重排片断导入原种鱼类的卵细胞中，和原种鱼类的基因组发生作用，形成变异的基因，并产生外形突变的个体，从中可以筛选生产性状优良的个体，进行进一步选育。并用目标区域扩增多态性(TRAP)方法判断DNA重排片断是否进入原种鱼类的基因组，并用两步扩增法获得变异的基因，为以后进行功能基因组研究提供一个基础，同时获得独特的分子标记。本发明方法简单，可广泛应用于鱼类以及其他动植物等育种和相关功能基因组的研究中。
文档编号C12N15/87GK101633936SQ200910183768
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者丁炜东, 曹哲明, 健 杨 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心