专利名称：转基因三系杂交棉育种的方法
技术领域：
本发明涉及农作物遗传育种，尤其涉及一种转基因三系杂交棉的育种方法。
杂种优势是生物界的普遍现象。农作物具有明显的杂种优势，杂种常比纯种增产15％以上，是当今提高作物产量乃至品质和抗性的重要手段。如玉米、水稻、油菜、高梁等农作物的杂种优势带来的高产和优质对世界食物安全已作出了巨大贡献。
三系，即雄性不育系、保持系和恢复系，是利用植物细胞质雄性不育进行杂种种子生产(制种)的体系。三系应有可繁殖性，不育系自身不能产生有活性的花粉粒，它的繁殖是通过保持系供给花粉而实现，保持系和恢复系雄性正常可育，分别自交可繁殖子代。不育系与恢复系间隔种植时，由于传粉媒介的存在，不育系从恢复系获取花粉后所结的种子即为杂种种子。这种杂种种子的生产方式被称为“三系法”制种。其优点是在制种时省去了人工“去雄”和“授粉”两个环节。利用细胞质雄性不育的三系法制种是当今农作物杂种种子的主要制种方式，如杂交玉米、杂交稻和杂交油菜的制种。
棉花雄性不育三系的研究始于美国。60年代，育成分别具有异常棉(G.anomalum WaWara & Peyr)和亚洲棉(G.arboreum L.)细胞质的雄性不育类型，但由于育性不稳定，没有实现“三系”配套。70年代，Meyer(1973)育成和发放具有哈克尼西棉(G.harknessii Brand.)细胞质的雄性不育系，但由于恢复系存在恢复力不强等缺陷，一直未能实现三系杂交棉种子的产业化。中国自80年代中期从美国引入哈克尼西棉细胞质雄性不育“三系”以来，也相继育成一批有一定育种价值的材料，但也未见在生产上成功应用的报道。目前，国际上棉花杂交种子主要是通过“人工去雄授粉法”获得，但它化工、化时和成本高，大面积应用受到限制。
本发明的目的是提供一种通过转基因的方法育成对棉花细胞质雄性不育系具有强恢复力的恢复系，并与不育系杂交能表现出强优势的转基因三系杂交棉的育种方法。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施。
转基因三系杂交棉育种方法的步骤如下1)采用转基因方法，将异源谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)基因导入待改良的棉花细胞质雄性不育的恢复系中，育成对雄性不育系的育性恢复具有强恢复力的转基因恢复系，即转GST基因的强恢复系及其衍生系；2)采用杂交育种方法，将抗病、虫基因转育到不育系中，育成对棉花枯萎病、棉铃虫和红铃虫有抗性的细胞质雄性不育系，即抗病、虫的不育系及其衍生系；3)以抗病、虫不育系为母本，以转基因恢复系系为父本，测交和筛选出在产量、品质和抗性上具有强优势的杂种F1组合。
本发明是用转基因方法将谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因导入待改良的现有恢复系中，育成转基因强恢复系“浙大强恢”。与受体恢复系比较，浙大强恢对不育系的恢复力提高了15.2-25.8％，从而使杂种F1单株结铃数多3-4个，不孕籽率降低5-10％，皮棉产量提高10-20％。从而，有效地克服了世界上尚未克服的恢复系对不育系恢复力不强的缺陷。另外，浙大强恢通过育种选择也克服了以往恢复系携带的“裂根”和“矮生扭曲顶叶”等不良性状。用该转基因恢复系配制的杂种“浙杂166”花粉育性好，使棉株结铃多和棉铃不孕籽率低，杂种优势得到了充分表达。1999-2000年，浙杂166在浙江省的金华、兰溪、浦江、上虞、余姚、海盐和三门等地的试种，平均皮棉产量比当地推广良种增产10％以上。不育系的繁殖产量和杂种的制种产量，在浙江大学实验农场等地，连续两年稳定在100公斤/亩以上。
下面结合实施例对本发明作详细说明转基因三系杂交棉的育种方法中的三系是指棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系，转基因是指用基因克隆和转化方法从海岛棉类型的品种中得到一个GST基因并将其导入到陆地棉类型的恢复系中的过程，制种是指不育系与其恢复系杂交生产杂种第一代种子的过程，杂种第一代棉花称为杂交棉，用杂种F1表示，杂种F1具有产量、品质和抗性的优势。
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因是指用PCR法从海岛棉(G.barbadenseL.)品种PimaS4基因组DAN中分离的对棉花花粉育性提高有促进作用的基因，海岛棉GST基因相对于陆地棉而言是异源基因。
恢复系的恢复力是指以恢复系为父本与不育系杂交产生的杂种F1花粉的可育程度。待改良的恢复系即为GST基因的受体恢复系，因用它配制成的杂种F1的花粉的可育程度低，所以它对不育系的恢复力弱；转基因恢复系即为导入异源GST基因后改良了的恢复系，因用它配制成的杂种F1的花粉的可育程度高，所以它对不育系具有强的恢复力。
转基因恢复系是指GST基因与根癌农杆菌Ti质粒重组后，用农杆菌介导法转化在恢复力上待改良的恢复系花粉，转化花粉授粉于受体恢复系，获含GST基因的转化子，经育种选择育成的恢复系；该恢复系作父本与不育系杂交所获的杂交棉，其花粉育性得到极显著提高，及其杂种优势得到强的表现。
抗病基因为抗棉花枯萎病的Fr基因，抗虫基因为抗棉花红铃虫和棉铃虫的Bt基因。
衍生系是指以转基因恢复系为基础材料而育成的有血缘关系的恢复系，以及以抗病、虫的不育系为基础材料而育成的有血缘关系的不育系。
测交和筛选是指若干雄性不育系与其相应恢复系杂交所获若干杂种F1在产量和品质上的优势测定和选择。
实施例1)用PCR扩增法，从海岛棉(G.barbadense L.)品种PimaS4基因DNA中分离出谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)基因；用基因克隆技术，将GST基因插入根癌农杆菌Ti质粒获重组载体；用农杆菌介导法将含GST基因的重组载体转化待改良恢复系的花粉，转化的花粉授予待改良的恢复系的柱头上获转GST基因的种子，通过转GST基因棉株的分子生物学检测和筛选获原始转基因恢复系，供进一步选择与改良。
GST基因导入待改良的恢复系后，获得的转化子进行自交，在自交群体中选择花器大、花药大而饱满、散粉好的单株。初选的单株自交，并与不育系测交(测交用于测量恢复系对不育系育性恢复的能力的方法，恢复系的恢复力用杂种F1的可育花粉率表示)，分别获自交和测交种子。
上年所获的自交种子(恢复系)和测交种子(杂种F1)播种后，在开花期，选取花粉育性好的杂种F1所对应的恢复系，从中选择优良单株进行自交，并与不育系测交，从而，再次获得自交和测交种子。如此经过3-5轮的选择、自交和测交，育成一个对不育系有强恢复力的恢复系，记为“浙大强恢”。
浙大强恢与原恢复系(GST基因受体)比较，对不育系的恢复力提高了15.2-25.8％，从而使杂种F1单株结铃数多3-4个，不孕籽率降低5-10％，皮棉产量提高10-20％。由于用“浙大强恢”配制的杂种“浙杂166”花粉育性好，使棉株结铃多和棉铃不孕籽率低，杂种优势得到了充分表达。
浙大强恢的植株形态类似于陆地棉的普通品种，但它的花器比普通品种大，尤其花药大、饱满、花粉多；它的细胞质属哈克尼西棉(Gossypium harknessiiBrand.)细胞质类型，它的细胞核属陆地棉(Gossypium hirsutum L)类型。
2)以棉花细胞质雄性不育系“中12A”为母本，含抗病Fr基因和抗虫Bt基因的陆地棉抗病虫品系“I011”为父本，进行有性杂交获得的杂种F1仍为不育。上年的杂种F1与抗病虫棉(I011)回交，获回交群体BC1。在随后各回交世代中，均选择抗病虫性强的不育单株与抗病虫棉(I011，轮回亲本)进行回交。如此连续回交5代以上，所获的不育优良株系即为抗病虫不育系，记为“抗A”，相对应的轮回亲本即为该不育系的保持系，记为“抗B”。
抗A不育系的植株形态类似于陆地棉的普通品种，但它的花器比普通品种小，尤其花药干瘪、瘦小、无花粉；它的细胞质属哈克尼西棉(Gossypium harknessiiBrand.)细胞质类型，它的细胞核属陆地棉(Gossypium hirsutum L)类型；它的细胞学特征是，花药绒毡层细胞退化、花粉母细胞在四分体形成前就死亡；它的不育性可被转基因恢复系(浙大强恢)恢复为完全可育。
3)以转基因恢复系浙大强恢及其衍生系为父本，与抗病虫不育系抗A及其衍生系进行双列杂交，获得不同组合的杂交种经过3次重复随机区组的比较试验，筛选出在产量、品质和抗性上具有显著优势的三系杂交棉组合“浙杂166”。
杂交棉(浙杂166)制种时，在制种田中每播不育系种子4-6行插播恢复系种子2行，即不育系与恢复系的间隔种植比例为4-6∶2，在有天然异交的条件下，不育系所结的种子为杂种种子。
权利要求
1.一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于它的步骤如下1)采用转基因方法，将异源谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)基因导入待改良的棉花恢复系中，育成对雄性不育系的育性恢复具有强恢复力的转基因恢复系，即转GST基因的强恢复系及其衍生系；2)采用杂交育种方法，将抗病、虫基因转育到不育系中，育成对棉花枯萎病、棉铃虫和红铃虫有抗性的细胞质雄性不育系，即抗病、虫的不育系及其衍生系；3)以抗病、虫不育系为母本，以转基因恢复系系为父本，测交和筛选出在产量、品质和抗性上具有强优势的杂种F1组合。
2.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的三系是指棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系，转基因是指用基因克隆和转化方法从海岛棉类型的品种中得到一个GST基因并将其导入到陆地棉类型的恢复系中的过程，制种是指不育系与其恢复系杂交生产杂种第一代种子的过程，杂种第一代棉花称为杂交棉，用杂种F1表示，杂种F1具有产量、品质和抗性的优势。
3.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因是指用PCR法从海岛棉(G.barbadenseL.)品种PimaS4基因组DAN中分离的对棉花花粉育性提高有促进作用的基因，海岛棉GST基因相对于陆地棉而言是异源基因。
4.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的恢复系的恢复力是指以恢复系为父本与不育系杂交产生的杂种F1花粉的可育程度。待改良的恢复系即为GST基因的受体恢复系，因用它配制成的杂种F1的花粉的可育程度低，所以它对不育系的恢复力弱；转基因恢复系即为导入异源GST基因后改良了的恢复系，因用它配制成的杂种F1的花粉的可育程度高，所以它对不育系具有强的恢复力。
5.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的转基因恢复系是指GST基因与根癌农杆菌Ti质粒重组后，用农杆菌介导法转化在恢复力上待改良的恢复系花粉，转化花粉授粉于受体恢复系，获含GST基因的转化子，经育种选择育成的恢复系；该恢复系作父本与不育系杂交所获的杂交棉，其花粉育性得到极显著提高，及其杂种优势得到强的表现。
6.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的抗病基因为抗棉花枯萎病的Fr基因，抗虫基因为抗棉花红铃虫和棉铃虫的Bt基因。
7.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的衍生系是指以转基因恢复系为基础材料而育成的有血缘关系的恢复系，以及以抗病、虫的不育系为基础材料而育成的有血缘关系的不育系。
8.根据权利要求1所述的一种转基因三系杂交棉的育种方法，其特征在于所说的测交和筛选是指若干雄性不育系与其相应恢复系杂交所获若干杂种F1在产量和品质上的优势测定和选择。
全文摘要
本发明公开了一种转基因三系杂交棉育种的方法。它是将异源谷胱甘肽－S－转移酶基因导入待改良的恢复系中,育成对细胞质雄性不育系的育性恢复具有强恢复力的转基因恢复系;将抗病、虫基因转育到不育系中,育成对棉花枯萎病、棉铃虫和红铃虫有抗性的细胞质雄性不育系;通过抗病、虫不育系与转基因恢复系测交和筛选,育成在产量、品质和抗性上具有强优势的杂种F
文档编号A01H1/02GK1375188SQ0111159
公开日2002年10月23日 申请日期2001年3月20日 优先权日2001年3月20日
发明者王学德 申请人:浙江大学