专利名称：一种转精氨酸酶基因玉米育种方法
技术领域：
本发明属于农业育种领域，具体是涉及一种转精氨酸酶基因玉米育种方法。
背景技术：
玉米(Zea maysL.)是世界上重要的粮食、饲料作物，也是现代工业的重要原料。随着工农业的发展及世界人口的增长，对玉米的需求量逐年攀升。据相关研究推测，到2020年世界玉米需求量将达到7. 53亿t，届时中国玉米需求量为2. 14亿t，将使玉米生产面临巨大挑战。但传统的育种方法面临着推广品种单一化，育种材料遗传基础越来越狭窄，基因库日益贫乏等问题，加之常规育种周期长，预见性差，很难使作物在产量、质量和抗性方面有大的提闻。近年来，随着生物技术的迅速发展和不断完善，采用基因工程手段进行作物遗传育种和新种质的创造已成为可能，运用转基因技术提高作物产量的报道屡见不鲜。Dinkins等(2003)利用基因枪技术将15kDaS-玉米醇溶蛋白基因转入大豆中，对转基因后代进行氨基酸组分分析，发现甲硫氨酸提高了 12%_20%，半胱氨酸提高了 15%-35%，而其他的氨基酸组分没有发生明显的变化。丁明忠等(2000)利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA导入玉米，筛选到8个高蛋白材料，玉米种子中蛋白质含量比对照提高20%。Zheng等(1995)将菜豆种子蛋白质基因导入水稻中表达，使得转基因水稻种子总蛋白含量增加4%，赖氨酸含量也有所提高。Regierer等(2002)把修饰过的质体腺苷酸激酶基因导入马铃薯中，转基因马铃薯块茎中腺苷酸水平得到明显提高，淀粉含量增加了 60%，块茎产量增加了39%。这些研究成果，为高产育种技术奠定了基础，也表明了随着转基因技术的兴起，优质、闻广的良种选育技术将步入一条快速、薪新的道路。产量是一个较为复杂的农艺性状，受多种基因与环境的相互作用所控制其中，光合作用，氮素同化，碳源分配 ，植株株型等生理过程是产量形成的基础。产量性状一直是作物育种计划的主要目标性状，近年来伴随人口激增，可耕地面积减少，农业环境逐渐恶化，世界粮食安全问题愈加突出，提高作物单位面积粮食产量显得更为重要。虽然目前对产量性状分子机制的研究尚处于初步阶段(van Camp，2005)，但许多与产量形成密切相关的生理过程，如光合作用、碳源分配、淀粉合成等的分子机制已逐步被揭开。随着植物基因组测序工程的逐渐完善，控制上述生理过程的许多基因已被成功分离(表I )，并通过基因工程手段对其进行遗传修饰，最终获得了产量性状得以明显改善的转基因植物。表I部分产量相关基因及其功能TablelParts of genes related to grain yield and their functions
权利要求
1.一种转精氨酸酶基因玉米育种方法，其包括如下步骤 (1)以pCAMBIA5300-ub1-Tnos为基础载体，去除原来载体的HPT基因，换上了来自NK603中35S驱动的CP4EPSPS基因，将精氨酸酶基因ZmArg、异戊烯基转移酶基因ZmIPT2和细胞壁转化酶基因ZmMnl插入多克隆位点Sma I之后，构建单子叶植物超量表达载体； (2)单子叶植物超量表达载体经三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌； (3)试验材料的准备自交系玉米种子分别在60-80%酒精浸泡40s-50，O.05-0. 15%升萊消毒8-12min,无菌水冲洗,然后将种子浸泡在无菌水中，置于37°C水浴中4 5h ; (4)农杆菌侵染萌动胚在超净台里用解剖刀在玉米萌动胚的生长点处划开I 3mm的口子，放入制备好的农杆菌工程菌液中浸染芽尖，26-30°C，200-240r/min振荡20_28h，然后把种子放在MS固体培养基上共培养2-4d ； (5)移栽用清水洗掉菌体，转入2-6mg/LPPT的选择培养基中培养7_10天，除去矮化、生长缓慢的植株，选择正常的移栽到装有灭菌蛭石的营养钵中； (6)在转化苗长到3-4叶期时，均匀喷洒合适浓度的草甘膦水溶液行筛选，存活植株长到5-6叶期时移栽到田间收获目标玉米种。
2.根据权利要求1所述的育种方法，所述的ZmArg基因序列为SEQID NO.1。
3.根据权利要求1所述的育种方法，所述的步骤(I)具体步骤如下 (1)用SacII和Aat II双酶切载体pCAMBIA5300去除潮霉素基因(HPT)后，将其左边界(T-border)序列重组连接,连接产物转化E. coli DH5,挑取单菌落碱裂解法提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定； (2)将EPSPS基因与经AatII酶切去除潮霉素基因的载体pCAMBIA5300后重组连接，产物转化E. coli DH5感受态细胞，挑取单菌落振荡培养过夜并用碱裂解法提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定和质粒PCR检测； (3)将扩增得到的ZmArg基因和经SmaI酶切后的线性中间载体；pCAMBIA5300_EPSPS重组连接，转化E. coli DH5感受态细胞，挑取单菌落震荡培养过夜并用碱裂解法提取质粒; (4)三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌。
4.根据权利要求1所述的育种方法，所述的自交系玉米种子选自KF298、KF513或K10。
全文摘要
本发明公开了一种转精氨酸酶基因玉米育种方法，由玉米中克隆ZmArg基因，采用农杆菌介导法转化玉米极早熟自交系，创造高产玉米新种质。采用本发明的方法能高效的将外源ZmArg基因已转入玉米自交系中，并且成功表达，在玉米生长的各个时期的精氨酸酶水平都有所提高，穗粗、粒长、粒宽等产量性状也有相应的增加。
文档编号C12N15/82GK103045641SQ201310004209
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月7日 优先权日2013年1月7日
发明者王振华, 邸宏, 曾兴, 张 林, 刘显君, 翁建峰, 张佩 申请人:曾兴