稻瘟病抗病基因Pi-ta辅助育种的InDel分子标记、标记方法、引物与用途
【专利摘要】本发明是一种稻瘟病抗病基因Pi-ta辅助育种的InDel分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1。本发明还公开了一种PCR扩增稻瘟病抗病基因Pi-ta辅助育种的InDel分子标记的扩增引物；以及稻瘟病抗性基因Pi-ta辅助育种的InDel分子标记在Pi-ta抗性位点的基因分型或者Pi-ta基因的辅助选择育种中的用途，本发明还公开了稻瘟病抗病基因Pi-ta辅助育种的InDel分子标记的功能标记方法。本发明具有操作简便、节约成本的优点，尤其适合于育种中的大规模Pi-ta抗性基因鉴定及标记辅助选择育种，适于推广应用。
【专利说明】稻瘍病抗病基因/V-1a辅助育种的InDeI分子标记、标记方法、引物与用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及稻瘟病抗病基因的功能标记、标记方法、扩增引物与用途，属于作物分子育种领域。
【背景技术】
[0002]水稻稻痕病由子囊菌Magnaporthe grisea (Hebert)Barr引起，是世界水稻生产中最严重的病害之一，每年因稻瘟病导致的损失，约占总产量的10-15% (Zheng etal.，2009)。目前，控制稻瘟病的主要手段是喷洒农药和应用抗病品种，前者会对环境造成一定的污染，不利于农业的可持续发展；后者虽是安全有效的途径，但由于稻瘟菌生理小种的易变性，往往会导致单个抗病位点的水稻品种在种植3-5年后将会丧失抗性。实践证明聚合多个抗病基因可有效持久抵御稻瘟病的侵染，因此，挖掘并合理利用抗病种质资源是解决这一病害的最佳举措。截至2013年8月，已至少报道了 68个抗稻瘟病位点共83 个主效基因(http://www.ricedata.cn/gene/gene_p1.htm),据此，前人已开发了一批与这些基因紧密连锁的分子标记或基因序列本身的功能标记(Qu et al.，2006，Liu etal.，2008，Zhang et al.，2013)，它们为水稻抗病基因分型及抗病聚合育种奠定了基础。
[0003]P1-ta是一个具广谱抗性的显性稻瘟病抗性基因，该基因编码产物能与稻瘟病菌的无毒基因J互作，引起抗病反应(Byran et al.，2000)。因此，挖掘并有效利用该基因将有助于水稻稻瘟病的抗性育种研究。前人利用该基因抗性位点与感病基因有一个碱基的差异，开发出三引物或四引物的SNP标记，但其中或存在检测过程较为复杂，或对试验条件要求较高，不利于规模化对朽-te抗性位点分型及标记辅助育种(Jia etal., 2004, Hayashi et al., 2006, Wang et al., 2007, Zhang et al., 2013)。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种稻瘟病抗性基因P1-1a辅助育种的InDel (insertion-deletion)分子标记,其能用于P1-1a基因的辅助选择育种，同时有助于抗性位点的快速、系统地分型。
[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述稻瘟病抗病基因朽-te辅助育种的InDel分子标记的标记方法、扩增引物与用途。
[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种稻瘟病抗性基因辅助育种的InDel分子标记,该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
[0007]本发明的稻瘟病抗性基因朽辅助育种的InDel分子标记，是基于PCR技术，PCR扩增引物为下列引物对，核苷酸序列为5’ 一 3’，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC (SEQ ID N0.2),
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA (SEQ ID N0.3)
本发明还提供了稻瘟病抗性基因朽-to辅助育种的InDel分子标记的具体用途:用于对P1-ta抗性位点的基因分型，或用于P1-1a基因的辅助选择育种。
[0008]发明人在发明过程中，
首先，根据目前含有PHa抗病基因品种的序列，与感病品种“日本晴”序列比对，在朽-te抗病基因的2373位置，找到一个感病品种“日本晴”在该位置的一个“T”碱基的插入。
[0009]然后，本发明在插入的两侧开发了一对引物，利用该标记我们已对46份重要品种进行抗性位点的基因分型，并与四引物扩增受阻突变体系PCR相互比较，分型结果完
全一致。[0010]本发明的具体技术内容如下:为了能够找到一个便于应用的朽-1a分子功能标记，我们根据已公布的抗病位点在不同品种中的序列，比较抗感序列之间的单核苷酸多态性，于朽-h基因的2373位置找到一个在感病品种中的单“T”插入(图1)。利用这个SNP设计了一个InDel分子标记，并对46份重要品种进行PCR扩增，利用12%PAGE(polyacrylamide gelelectrophoresis)电泳检测到25份和阳性对照一致的带型，其余21份则为阴性带型；同时，我们还应用四引物扩增受阻突变体系PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测这些品种，得到完全一致的结果(图2，3)。该InDel标记能对很多品种进行有效的分型，可提高A'-1a基因在育种中的效率。
[0011]相对于现有技术，本发明具有操作简便、节约成本的优点，尤其适合于育种中的大规模抗性基因鉴定及标记辅助选择育种，适于推广应用。
[0012]【专利附图】
【附图说明】
图1,含P1-ta抗性基因的不同水稻品种与感病品种“日本晴”在InDel标记位点的序列Alignment分析图,框内碱基即为本发明的InDel标记所在的SNP位点；
图2,本发明InDel标记的设计图；
图3,不同水稻品种的InDel分子标记的电泳分析图；
图3中:M:marker; 1-48:Tet印、日本晴、早恢89、圭630、盐都295、镇稻187、连嘉粳I号、长粒爪、C101PKT、培矮64、连丰糯、F-124-1、明恢63、桂朝2号、宁恢627、吉粳509、盐丰47、盐粳456、圣稻068、盐粳16、嘉花I号、新稻22、新稻10号、明恢86、蜀恢527、广恢128、辽粳727、台湾50、连粳7号、密阳46、9311、扬稻2号、台湾65、抗盐100、Tequing、台湾30、宁恢311、津1007、先恢207、津原85、津粳235、郑稻19、蜀恢881、中花15、广占63S、巴西陆稻、淮糯12、台湾65。
[0013]图4，按图3不同水稻品种的顺序，采用四引物扩增受阻突变体系PCR扩增的电泳分析图；
图5，按明恢86和蜀恢527配组的F2代，1:明恢86，2:蜀恢527，3-23是F2代株系。
[0014]【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0015]实施例1，一种稻痕病抗病基因辅助育种的InDel分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
[0016]实施例2，一种PCR扩增实施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a辅助育种的InDel分子标记的扩增引物，所述的PCR扩增引物为下列引物对，其核苷酸序列为5’ 一 3’正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
[0017]实施例3，实施例1所述的稻瘟病抗性基因P1-ta辅助育种的InDel分子标记在P1-ta抗性位点的基因分型或者基因的辅助选择育种中的用途。
[0018]实施例4，参照图1-5，实施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a辅助育种的InDel分子标记的功能标记方法，其步骤如下:
1.根据对含朽-1a抗性基因的7个品种——(Tetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1)测序，其序列分别参见SEQ ID N0.4 — SEQ ID N0.10，并与日本晴序列进行比对分析，发现在朽-te基因的2373位点处，感病品种“日本晴”有一个” T”插入，由此，我们在此SNP前后设计一对PCR引物，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，
PCR扩增的产物在朽-te抗性基因为44 bp,感病基因为45 bp。图1为以Tet印的P1-ta基因为参照，与截取其它品种中的包含设计引物序列的比对。
[0019]2.DNA提取:按CTAB法提取水稻基因组DNA。
[0020]3.PCR扩增PCR扩增反应体系为:2 X Taq Master Mix 12.5 μ I,上游引物(10μ mol/L) I μ?，下游引物(10 μ mol/L) I μ?,模板DNA I μ?,反应总体积25 μ I。反应程序为:94°C预变性5 min，94°C变性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35个循环，72°C延伸10 min，4°C保存。
[0021 ] 4.PCR产物电泳:配制12%的PAGE，取步骤3扩增所得的PCR产物2.0 μ I，以DNAMARKERDL500作为分子量对照，亲本分型采用双垂直电泳槽，在170V恒压下电泳1:30小时，F2分型采用垂直电泳槽，在100V恒压下电泳10:00小时。银染显示DNA条带。
[0022]5.电泳图谱分析:用凝胶成像系统拍照，通过比对DNAMarker找到目标条带，根据片段大小判断抗感基因。
[0023]SEQ ID N0.1中2343— 2435序列为该发明设计引物的区域。
[0024]为了证明本发明的适用性，本发明设置了如下对比试验:
实验1，随机选取国内不同地区比较有代表性的品种46个，以本发明的PCR标记与前人开发的四引物扩增受阻突变体系进行PCR扩增对比分析，结果完全一致。
[0025]实验2，以本发明标记分型的抗性品种明恢86与感性品种蜀恢527杂交，F2代随机取样21株进行抗性位点的基因分型(如图5)，结果显示抗性、感性及杂合带型都能比较明显区分出来。
[0026]以上列举的仅限于本发明具体实施例，事实上还应有许多变形，若本领域的相关人员能从本发明公开的内容直接导出或引申出的所有变形，均应为本发明的保护范围。
[0027]SEQUENCE LISTING
〈110〉江苏金万禾农业科技有限公司 江苏胜田农业科技发展有限公司 〈120〉稻痕病抗病基因P1-ta辅助育种的InDel分子标记、标记方法、扩增引物与用途 〈160〉 10
<170> PatentIn version 3.3
【权利要求】
1.一种稻痕病抗病基因/辅助育种的InDel分子标记,其特征在于:该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
2.—种PCR扩增权利要求1所述的稻瘟病抗病基因辅助育种的InDel分子标记的扩增引物，其特征在于:所述的PCR扩增引物为下列引物对，其核苷酸序列为5’ 一3’
正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2 ； 反向引物:TAGITTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
3.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因辅助育种的InDel分子标记在Pi_ta抗性位点的基因分型或者基因的辅助选择育种中的用途。
4.权利要求1所述的稻瘟病抗病基因辅助育种的InDel分子标记的功能标记方法，其特征在于，其步骤如下: (I)引物设计:根据对含朽-1a抗性基因的7个品种SEQ ID N0.4- SEQ ID N0.10, BPTetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1 进行测序，并与日本晴序列进行比对分析，发现在朽-te基因的2373位点处，感病品种“日本晴”有一个“T”插入，由此，在此SNP前后设计一对PCR引物，正向引物:GTACATGTTTCATACCC,反向引物:TAGTTTAGTCGCCTM，PCR扩增的产物在朽-1a抗性基因为44 bp,感病基因为45 bp ; (2) DNA提取:按CTAB法提取水稻基因组DNA ； (3)PCR 扩增:PCR 扩增反应体系为:2 X Ta^Master Mix 12.5 μ 1,10 μ mol/L 上游引物I μ 1， 10 μ mol/L下游引物I μ I,模板DNA I μ I,反应总体积25 μ I ;反应程序为:94°C预变性5 min， 94°C变性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35个循环，72°C延伸.10 min，4°C保存； (4)PCR产物电泳:配制12%的PAGE，取步骤3扩增所得的PCR产物2.0 μ 1，以DNAMARKERDL500作为分子量对照，亲本分型采用双垂直电泳槽，在170V恒压下电泳1:30小时，F2分型采用垂直电泳槽，在100V恒压下电泳10:00小时；银染显示DNA条带； (5)电泳图谱分析:用凝胶成像系统拍照，通过比对DNAMarker找到目标条带，根据片段大小判断抗感基因。
【文档编号】C12Q1/68GK103834648SQ201410112643
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】温以斌, 刘辉, 查日扬, 孟德龙, 潘启民 申请人:江苏金万禾农业科技有限公司, 江苏胜田农业科技发展有限公司