专利名称：一种农杆菌介导培育转基因大豆的方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌介导培育转基因大豆的方法。
背景技术：
与传统的育种技术相比，转基因育种技术的周期短、效率高、目的性强，是改良作物农艺性状的有效途径。目前，大豆转基因方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法，其中常用的是农杆菌介导法，该方法能够较完整地将T-DNA以单拷贝或低拷贝形式插入植物基因组中。虽然近几年来，农杆菌介导法转化大豆的技术已不断完善，但多数方法需经过外植体的脱分化和再分化的过程，且存在转化效率低、遗传稳定性差、转化周期长等问题。这些问题严重阻碍了功能基因的验证及转基因育种的进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因大豆的方法，该方法通过农杆菌介导将目的DNA转入大豆细胞，包括如下步骤:I)在大豆种子萌发幼苗的子叶节分生组织处注射含有目的DNA的重组农杆菌的悬浮液后，将所述幼苗进 行共培养；2)将经步骤I)共培养的所述幼苗直接进行长苗培养，即得到具有根、茎和叶的转基因大豆植株；所述共培养的目的是使所述目的DNA整合到大豆基因组中。在上述方法中，所述注射时的所述幼苗为种子萌发5 —10天(如5、7或10天)的幼苗。在上述方法中，由于所述幼苗上的顶芽和侧芽会发育成新的组织，为了避免未转基因组织的产生，使整个植株保持一致的转基因特性，在所述注射前，还可包括将所述幼苗的顶芽和侧芽去除的步骤。在上述方法中，所述重组农杆菌的悬浮液按照包括如下步骤的方法制备:将所述重组农杆菌悬浮于具有如下组成的液体培养基中形成所述重组农杆菌的悬浮液:溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为:1/10的B5基本培养基无机盐成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6_苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸 400-1000mg/L (如 400、700、或 1000mg/L)、二硫苏糖醇 154mg/L、硫代硫酸钠 158mg/L、乙酰丁香酮 0-300 μ mol/L (或为 50—300 μ mol/L、100—300 μ mol/L、150—300 μ mol/L 或 200一300 μ mol/L、具体可为 O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L、或 300 μ mol/L)、赤霉素 0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸lmg/L、盐酸批B多醇lmg/L、盐酸硫铵 10mg/L。在上述方法中，与所述液体培养基相比，所述重组农杆菌的悬浮液的OD6c 值为0.4一1.0 (如0.4、0.6、1.0);所述重组农杆菌的悬浮液的注射量为每个所述幼苗20—100 μ L (如 20,80,100 μ L)。在上述方法中，所述注射通过内径为0.06mm-lmm(如0.06、0.1或Imm)、外径为
0.2mm-1.14mm (如 0.2、0.24、1.14mm)的针头实现。在上述方法中，所述农杆菌为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。在上述方法中，所述共培养的条件为在温度25°C、黑暗条件下用水培养3天。本发明还提供了一种农杆菌侵染植物用的液体培养基，其溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为:1/10的B5基本培养基无机盐成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6-苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400-1000mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、硫 代硫酸钠158mg/L、乙酰丁香酮0-400 μ mol/L(或为O—300 u mol/L>50—300 u mol/L、100—300 u mol/L、150—300 u mol/L 或 200—300 u mol/L、具体可为 0 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L、或 300 μ mol/L)、赤霉素0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸lmg/L、盐酸批B多醇lmg/L、盐酸硫铵 10mg/L。在上述培养基中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为大豆。根据植物分生组织具有分生新细胞的特性、且为产生和分化其他各种组织的基础，本发明采用在大豆种子萌发幼苗的子叶节分生组织处以注射农杆菌悬浮液的方式，将目的DNA整合入大豆的染色体，获得转基因植株，整个过程不经过植物组织的脱分化和再分化的组织培养过程，不受无菌操作等实验条件(超净台、组培间)的限制，减少了化学试剂(如激素、抑菌剂)的使用量，具有操作简单、转化周期短、转化效率高(最高可达15.3%)、经济节约、应用范围广的优点。
图1为注射侵染大豆幼苗子叶节分生组织图。图2为叶片涂抹早按勝3天后的植株。图3为PCR检测转基因植株中除草剂抗性基因Bar的结果。其中，泳道M为分子量标准，从上至下的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道I一24为
待测转基因植株的扩增产物。图4为重组农杆菌悬浮液中使用不同浓度乙酰丁香酮对转化效率的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、农杆菌介导培育转基因大豆方案I1、重组农杆菌悬浮液的制备将含有除草剂抗性基因Bar的植物双元表达载体PB2GW7 (Binary gatewayoverexpression vector PB2GW7)(文献:Dubin MJ, Bowler C, Benvenuto G.A modifiedGateway cloning strategy for overexpressing tagged proteins in plants.Plantmethods,2008,4(3):1-11.公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得)转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (购自北京天恩泽基因科技有限公司)中，得到含有目的基因的重组根癌农杆菌EHA105/PB2GW7。将重组根癌农杆菌EHA105/PB2GW7的单菌落用含壮观霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP培养液(溶剂为水，溶质及其浓度分别为:氯化钠5g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L)于28°C培养至OD6tltl为0.8—1.2 ;4000rpm，离心lOmin，用如下液体培养基重悬至OD6tltl为0.6得到重组农杆菌的悬浮液:溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为:1/10的B5基本培养基无机盐成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6_苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸1000mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、硫代硫酸钠158mg/L、乙酰丁香酮 200 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸lmg/L、盐酸批B多醇lmg/L、盐酸硫铵 10mg/L。2、幼苗的准备挑取饱满且表面无病斑的大豆品种东农50种子，间隔一定距离置于润湿的双层滤纸间，包裹呈纸卷，放于塑料盒中水培，25°C、光周期为每天光照16小时、黑暗8小时、光照强度为ΙΟΟμπιοΙ.πΓ2.s-1的条件下培养至种子萌发7天，去除顶芽和侧芽，进行步骤3的注射侵染。3、注射侵染及共培养取步骤I制备的重组农杆菌的悬浮液，通过内径为0.1_、外径为0.24mm的管状针头注射(图1)到步骤2的去除顶芽和侧芽的所述幼芽的子叶节分生组织处，每个所述幼苗注射80 μ L，将所述幼苗置于25°C、黑暗、湿度为70%的条件下用水培养(即共培养)3天。4、成苗培养及筛选
将经步骤3共培养的幼苗移栽至土壤中于正常水肥条件下培养10天左右，直到长出三出复叶后，用100mg/L的草胺膦涂抹三出复叶的叶片，3天后，观察叶片是否变黄，部分结果如图2所示，野生型未转基因大豆东农20的阴性植株涂抹草胺膦的叶片变黄(图2中的左图)，转基因植株涂抹草胺膦的叶片仍为绿色(图2中的右图)。去除叶片变黄的植株，保留叶片无明显变化的植株。5、PCR 鉴定
取经步骤4经草胺膦筛选无明显变化的植株，提取基因组DNA，以该DNA为模板进行抗性基因Bar的PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物中含有440bp的Bar基因片段的植株为阳性转基因植株，不含有该片段的植株为阴性转基因植株，部分扩增结果如图3所不。上述PCR扩增使用的引物序列如下:扩增Bar 基因的正向引物:5’ -GCACCATCGTCAACCACTAC-3’ ；扩增Bar 基因的反向引物:5’ -TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’。6、实验结果步骤I一 5的实验设置三次重复，结果如表I所示。表1、农杆菌介导培育转基因大豆的统计结果
权利要求
1.培育转基因大豆的方法，通过农杆菌介导将目的DNA转入大豆细胞，其特征在于:所述方法包括如下步骤: 1)在大豆种子萌发幼苗的子叶节分生组织处注射含有目的DNA的重组农杆菌的悬浮液后，将所述幼苗进行共培养； 2)将经步骤I)共培养的所述幼苗直接进行长苗培养，即得到具有根、茎和叶的转基因大豆植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述注射时的所述幼苗为种子萌发5—10天的幼苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述注射前，包括将所述幼苗的顶芽和侧芽去除的步骤。
4.根据权利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于:所述重组农杆菌的悬浮液按照包括如下步骤的方法制备:将所述重组农杆菌悬浮于具有如下组成的液体培养基中形成所述重组农杆菌的悬浮液:溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为:1/10的B5基本培养基无机盐 成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6-苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400_1000mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、硫代硫酸钠 158mg/L、乙酰丁香酮 0-300 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ； 所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ； 所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸lmg/L、盐酸吡哆醇lmg/L、盐酸硫铵10mg/Lo
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:与所述液体培养基相比，所述重组农杆菌的悬浮液的0D_值为0.4-1.0 ;所述重组农杆菌的悬浮液的注射量为每个所述幼苗20_100u L0
6.根据权利要求1一5中任一所述的方法，其特征在于:所述注射通过内径为0.06mm-lmm、夕卜径为0.20mm一1.14mm的针头实现。
7.根据权利要求1一6中任一所述的方法，其特征在于:所述农杆菌为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。
8.根据权利要求1一7中任一所述的方法，其特征在于:所述共培养的条件为在温度25 °C、黑暗条件下用水培养3天。
9.一种农杆菌侵染植物用的液体培养基，其特征在于:所述液体培养基的溶剂为水，溶质及其在所述液体培养基中的终浓度分别为:1/10的B5基本培养基无机盐成分、B5基本培养基有机成分、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸3.9g/L、6-苄基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400_1000mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、硫代硫酸钠158mg/L、乙酰丁香酮0-300 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ； 所述1/10的B5基本培养基无机盐成分为KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ； 所述B5基本培养基有机成分为肌醇100mg/L、烟酸lmg/L、盐酸吡哆醇lmg/L、盐酸硫铵10mg/Lo
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具 体可为大豆。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌介导培育转基因大豆的方法。该方法是通过农杆菌介导将目的DNA转入大豆细胞，包括如下步骤1)在大豆种子萌发幼苗的子叶节分生组织处注射含有目的DNA的重组农杆菌的悬浮液后，将所述幼苗进行共培养；2)将经步骤1)共培养的所述幼苗直接进行长苗培养，即得到具有根、茎和叶的转基因大豆植株。本发明具有操作简单、转化周期短、转化效率高(最高可达15.3%)、经济节约、应用范围广的优点。
文档编号C12N15/82GK103224954SQ20131019371
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月23日 优先权日2013年5月23日
发明者陈李淼, 沙爱华, 张晓娟, 单志慧, 陈水莲, 张婵娟, 邱徳珍, 周蓉, 周新安 申请人:中国农业科学院油料作物研究所