专利名称：一种烟蚜hunchback基因cDNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于昆虫分子生物学与植物基因工程领域，具体涉及一种烟蚜胚胎发育关键基因hunchback (.Mphb ) cDNA的克隆，表达Mphb dsRNA转基因烟草的获得。
背景技术：
刺吸式口器害虫是一类重要的农业害虫，主要包括同翅目、半翅目、及部分双翅目昆虫，如稻飞虱，稻叶蝉，棉盲蝽及各种蚜虫等。刺吸式口器害虫常群居于嫩枝、叶、芽、花蕾、果上，汲取植物汁液，掠夺其营养，造成枝叶及花卷曲，甚至整株枯萎或死亡。如稻飞虱一般危害损失为2到3成，严重危害损失3到5成，甚至绝收。而棉盲蝽近年来已上升为
棉田主要害虫,转基因抗虫棉被棉盲蝽为害后,蕾铃大量脱落,成铃率明显降低,棉花产量与品质大幅度下降。刺吸式口器害虫还能传播各种病毒，蚜虫传播植物病毒病的能力更是居病毒媒介昆虫的首位，仅桃蚜一种至少可传播107种植物病毒病，棉蚜一种至少可传播55种植物病毒病。传播病毒病所造成的危害往往远远超过蚜虫本身造成的危害(宋新元，2005)。烟蚜是重要的刺吸式口器害虫，食性杂，寄主广泛，除危害烟草夕卜，还危害桃、李、梨等果树、油菜、白菜、甘蓝、芥菜、萝卜等十字花科蔬菜以及瓜类、茄类和多种花卉林木。烟蚜发生数量大，危害时间长。若蚜或成蚜以口针刺入叶肉、嫩茎或嫩蕾、花、果吸食汁液，严重时致失水而叶片卷缩、变形，生长缓慢，组织破坏甚至死亡。烟蚜还可传播黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)等多种病毒，对农业生产造成重大损失。目前，刺吸式口器害虫防治主要依赖于具有强触杀作用和内吸作用的化学农药，如乐果、马拉硫磷和溴氰菊酯等。化学杀虫剂在害虫防控中发挥了重要作用，但长期使用会破坏生态环境，危害人类健康。常规育种在抗虫作物品种培育中发挥了重要的作用，但单纯的常规育种手段周期较长，且受远缘杂交不亲和的限制，远缘物种的优良抗虫基因难以被快速有效地利用。一些病原微生物能诱发刺吸式口器害虫流行病，但多数是昆虫专性病原真菌，一般较难培养和生产，目前在实际应用方面还存在一定困难。通过白僵菌、绿僵菌等生防真菌以及信息素、植物凝集素防治刺吸式口器害虫尚处在研究与探索阶段，目前国内尚未有针对刺吸式口器害虫的高效生物农药在大田推广应用。而天敌昆虫如瓢虫、蚜茧蜂、草蛉等的大规模饲养和释放还比较困难，成本较高，短期内难以发展成为一种常规生防措施在农业生产上大面积推广应用。随着现代生物技术的发展，植物基因工程在农业上的应用取得了巨大的进展，目前己有转基因植物抗刺吸式口器害虫的报道，所用的基因主要有Bt蛋白基因，蛋白酶抑制剂基因，植物凝集素基因。而且有报道称，害虫对转基因植物的耐受性有上升的趋势。RNA干扰(RNA Interference,RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象,小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中发挥关键作用。RNA干涉普遍存在于植物、动物和真菌中，是真核生物中存在的一种抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi技术在农业害虫生物防治领域具有广阔的应用前景。1998年,有科学家首次利用RNAi技术研究了黑腹果蝇与frizzled2基因的功能。随后的众多研究也表明，在注射或进食靶标序列dsRNA后，昆虫靶标基因的表达也可被有效阻断。通过体外显微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害虫稻飞虱不同表达模式的基因。黄曲条跳甲在注射跨膜气味受体基因dsRNA后，对十字花科寄主的偏好性减弱。在人工饲料中添加三磷酸腺苷酶基因dsRNA后，玉米根萤叶甲iicavirgifera rirgi/era)三磷酸腺苷酶基因表达明显受抑制,幼虫生长停滞甚至死亡。棉铃虫有一受棉酚诱导的P450全长基因GIP,当棉铃虫幼虫进食表达P450全长基因GIP dsRNA的转基因烟草后，幼虫中肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升，同时由于棉铃虫中肠内的表达的下调而使幼虫生长受到抑制，对棉酚的耐受性降低。此外，通过dsRNA饲喂对白蚁内源纤维素基因与Hexamerin储存蛋白基因的干扰具有致死与致畸效应。经dsRNA饲喂后默R比亚按蚊的几丁质酶基因可被有效沉默。有报道称在水稻中表达跨膜转运蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻对稻褐飞虱的抗性。除在害虫生物防治中的应用外，RNAi技术也是昆虫功能基因组研究的重要手段，目前已被广泛应用于昆虫胚胎发育的基因调控研究，但主要限于有性繁殖的昆虫如果蝇、谷盗和金小蜂等。间隙基因m编码一含锌指的转录因子，是昆虫胚胎发育中负责体·节分化的关键基因之一，研究表明其在膜翅目，直翅目，双翅目，鞘翅目等昆虫中普遍存在，但拷贝数存在差异。从mRNA可由母体提供,也可在合子中合成。母体M mRNA合成受后端母体因子(nos)的调控，而合子的mRNA则受前端母体基因AicoitZ (bed)的控制。在果妮中，从与orthodenticle {otd)基思是bicoid Ocor)基因的下游革G基因，ActZ和从的互作激活W和另外两个前端间隙基因spiracles (ems)和buttonhead(btd)的表达。此外,从被发现在果蝇中枢神经系统细胞分化中发挥重要作用。昆虫M基因的沉默具有强烈的致畸与致死效应。果蝇功能缺失会导致颌和胸部体节的缺失。通过RNAi沉默拟谷盗属Tribolium和金小蜂yVasoflia的母体或合子A办基因后，其头部和胸部会发生缺陷。这些研究表明胎胚发育关键基因是害虫生物防治的一个潜在靶标。在目前膜翅目(如蚊子)、直翅目(如蝗虫)、半翅目(如蝽蟓)等昆虫的从基因部分mRNA序列已能查询。豆虫牙(Acyrthosiphon pi sum)全基因组序列已公布，豆虫牙力办(,Aphb )基因以单拷贝存在。但目前烟姆hunchback iMphb )尚未被克隆,更没有以Mphb为靶标来防治烟蚜的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种烟姆(妙^ 5· persicae、hunchback基通(Mphb)的cDNA及其应用，通过将烟蚜胚胎发育关键基因i^AkDNA转到植株中，获得表达Mphb dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物(特别是烟草)，烟蚜取食转基因烟草后，Mphb表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，日平均产蚜数减少，繁殖能力下降，从而用于烟蚜的生物防治。本发明提供的技术方案是一种物从基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。该序列是发明人首次从烟蚜中克隆的#/ 基因，该基因能够作为RNAi的靶标，在烟蚜的防治中具有很大的应用价值。本发明还提供所述cDNA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
一种所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤
(O从烟蚜成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ；
(2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQID NO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示；
(3)以步骤(I)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增；
(4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pMD18_T_i^^i的阳性克隆子；
(5)将步骤(4)所得的阳性克隆子进行序列测定，得到权利要求I所述的cDNA。一种所述cDNA的应用所述cDNA用于防治烟蚜，从所述的cDNA序列中选取427bp·(见SEQ ID NO. I中第303-729位核苷酸)作为干涉靶标，构建合成物况7 dsRNA的植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化获得表达#/ dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物，烟蚜取食所述转基因植物后，烟蚜的#/ 表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，繁殖能力下降。上述的应用，所述植物为烟草，果树，十字花科蔬菜，瓜类或茄类。上述的应用，其中，获得表达#/ dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因烟草的方法步骤如下
(Y)MphbdMk片段靶标序列的扩增与酶切位点的引入设计引物，扩增MphbcMk片段427bp靶标序列，在上下游分别引入I与BeuM I位点，所述弓I物正向序列如SEQ IDNO. 5所示，反向序列如SEQ ID NO. 6所示；
(2)纯化步骤(I)所得PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，选含pMD18_T_i^^i的阳性克隆子，培养阳性克隆子，从中提取PMD18-T-姆质粒；
(3)mi^-Mphbi酶切以获得靶标片段，酶切结束后，回收靶标片段；
(4)pUCCRNAi反向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi反向连接片段；
(5)pUCCRNAi反向连接片段与靶标片段连接得到pUCCRNAi-i^^-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pUCCRNAi-i^^-R的阳性克隆子；
(6)pUCCRNAi-i^^-R正向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi-R大片
段；
(8)pUCCRNAi-i^^-R大片段与姆靶标片段连接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pUCCRNAi-i^^-F-R的阳性克隆子；
(9)pUCCRNAi-i^^-F-RdsRNA表达框物从-F-R的酶切，酶切结束后，回收^CCmki-Mphb-V-R dsRNA 表达框片段姆AA-F-R ；
(10)pCAMBIA2300的酶切，酶切结束后，回收pCAMBIA2300大片段。(11) PCAMBIA2300大片段与Mphb dsRNA表达框片段Mphb-Y-R的连接得到植物表达载体pCAMBIA2300-i^^i，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含PCAMBIA2300-物从i的阳性克隆子；提取质粒pCAMBIA2300-物从i，通过酶切与测序，确认载体构建正确；
(12)植物表达载体pCAMBIA2300-i^^i转化根癌农杆菌；
(13)转基因烟草的获得采用叶盘转化法获得转基因烟草植株，将步骤(12)含有植物表达载体PCAMBIA2300-物从i的农杆菌接种于YEB培养基培养至OD6tltl=O. 6 I. 0，浸染烟草叶盘，然后将叶盘转移到共培养基进行暗培养，再将叶盘转移到分化培养基光照培养25-35天，保持28 30°C，分化出小苗后，将苗转移到生根培养基进行培养，生根后将苗移栽到土壤，繁殖到T2代。本发明具有以下有益效果
本发明首次从烟姆中克隆hunchback iMphb )基因cDNA。而且本发明人首次以Mphb为干涉靶标，通过植物介导的RNAi培育表达dsRNA的转基因烟草，沉默的转录表达，抑制烟蚜的繁殖与种群数量，研究基础好，前瞻性高，害虫产生抗性的风险低，是一种防治虫牙虫的好方法。本发明利用烟姆基因的cDNA通过培育表达dsRNA的烟草来防治蚜虫的方法具有双重干涉功能。mkMphb dsRNA的转基因烟草，被烟蚜取食后，烟蚜#/ 表达受抑制，神经系统发育被破坏，胚胎发育受阻，日平均产蚜数减少，繁殖
能力下降。此种转基因烟草可直接应用于大田生产，提高烟草对烟蚜的抗性，降低因烟蚜危害引起的损失，提高烟叶产量与经济价值。也可以将此种烟草与其它烟草品种杂交，育成新的抗烟蚜的烟草品种，并最终应用于大田生产。此外，本发明所述方法防治对象不仅包括直接取食转基因烟草的蚜虫，还包括蚜虫的胚胎(后代)，这样此方法又能通过双重途径防治蚜虫。因此，本发明虽然只针对一个干涉靶标基因，却具有双重干涉功能与双重防治途径的特点。由于烟蚜食性杂，寄主广泛，除危害烟草外，还危害桃、李、梨等果树、油菜、白菜、甘蓝、芥菜、萝卜等十字花科蔬菜以及瓜类、茄类和多种花卉林木。因此，RNAi植物表达载体pCAMBIA2300-Mphbi载体可用于转化其它作物，以获得表达Mphb dsRNA的其它转基因作物，同样可用于烟蚜的生物防治。
图I A为烟蚜Affi7C从ad (物从)基因的克隆及RNAi植物表达载体的构建。M:250bp ladder marker ；1 -.Mphb cDNA (1325bp)。B 为雄祝 干涉祀标序列扩增。M DL2000marker ； I -Mphb 干涉祀标序列(427bp)
图2为RNAi植物表达载体的酶切验证。M λ -Hind III digest DNA marker ；1 RNAi植物表达载体pCAMBIA2300-i^^i用I酶切的结果，显示预期大小的两条带；2 :未经酶切的PCAMBIA2300-物从i。图3为通过根癌农杆菌介导转化获得转基因烟草的过程，以根癌农杆菌浸染烟草叶盘，经诱导，共培养，分化，生根，移栽最后获得转基因烟草。图4为转基因烟草的PCR检测。设计引物对為dsRNA表达框上游的的35S启动子序列进行扩增，得到预期的442bp条带，说明為dsRNA表达框序列已成功转化烟草。M DL2000 marker ;3、5、12为三个转化pCAMBIA2300-i^^i的转基因烟草株系；空白为转化PCAMBIA2300空载体的转基因烟草；野生型为没有经过转基因处理的野生型烟草。图5为烟蚜取食转基因烟草后日产蚜数减少。每株转基因(株系3、5、12)烟草接种10头新生若蚜，第7-12天统计每日产蚜数，以没有经过转基因处理的野生型烟草与转化PCAMBIA2300空载体的烟草为对照。每种烟草设8个重复。
图6为烟蚜取食转基因烟草后繁殖总量降低。每株转基因烟草接种10头新生若蚜，第14天统计单株烟蚜头数。图7为烟蚜取食转基因烟草后总生物量降低。每株转基因烟草接种10头新生若蚜，第14天统计单株烟草上的烟蚜总生物量。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。本发明从烟蚜中克隆到胚胎发育关键基因hunchback (Mphbm cDNA，它具有SEQID NO. I所示的序列
(1)SEQ ID NO. I 的信息
(a)序列特征
序列长度1325碱基对 类型核酸 链型双链 拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源烟姆(妙^ 5·per si cae )
(f)序列描述SEQID NO. I
(2)SEQ ID NO. 2 的信息
(a)序列特征
序列长度441氨基酸 类型氨基酸 链型单链 拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质
(c)序列描述SEQID NO. 2
本发明烟姆iMphb)基因cDNA的克隆方法,包括以下步骤
(O从烟蚜成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ；
(2)根据豆蚜、膜翅目、直翅目及半翅目昆虫d基因的保守序列设计简并引
物
Mphb forward: 5’ -AAAAANCACAARTGCAAACANTG-3’ (SEQ ID NO. 3)
Mphb reverse: 5_’ CCCATGTGSATMGWGTASAKGA-3’ (SEQ ID NO. 4)
(3)以cDNA为模板，PCR扩增MpM基因
PCR条件为首先将下述试剂混合在一起，
烟虫牙cDNA μ
脱氧核苷酸底物dNTPs 2μ1IOXTaq DNA聚合酶缓冲液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
Mphb forward (10M-M) O. 4M-1
Mphb reverse (10M-M) 0. 4M-1
ddH20 14μ1
总体积20μ1
反应条件为首先94°C预变性3分钟；然后进行如下循环94°C 30秒，57.6°C 30秒，72°C 80秒，共进行35循环；最后72°C延伸10分钟。如图IA所示，其中M为250bp ladder marker, I号泳道为预期的物从cDNA序列(1325bp)。(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含pMD18-T-i^^i的阳性克隆子；
(5)将步骤(4)所得的阳性克隆子进行序列测定，得到基因1325 bp序列。上述获得的姆 A6cDNA片段用于培育一种表达姆AAdsRNA的能抑制烟姆繁殖的转基因烟草，培育步骤如下
(l)##6cDNA片段靶标序列的扩增与酶切位点的引入。设计引物，扩增姆AkDNA片段下游427bp靶标序列(见SEQ ID NO. I中第303-729位核苷酸)，在上下游分别引入I与BamW I位点，引物序列如下
MphbiY 办’ -TGTCGACCAGCCTCAAGCAGCATC-3，( Sal I ) (SEQ ID NO. 5)
Mphb iR 5 -CGGATCCCGACGAGGAGTTGTTATT-3 ( BamH I ) (SEQ ID NO. 6)
PCR条件为首先将下述试剂混合在一起，
ΡΜ 18- -MpAbi 质粒O. 5μ1
脱氧核苷酸底物dNTPs 2μ1
IOXTaq DNA聚合酶缓冲液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
Mphb iF (ΙΟμΜ) O. 4μ1
Mphb iR (ΙΟμΜ) O. 4μ1
ddH20 14. 5μ1
总体积20μ1
反应条件为首先94°C预变性3分钟；然后进行如下循环94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 45秒，共进行35循环；最后72°C延伸10分钟。如图IB所示，其中M为DL2000 marker,I号泳道为预期的427bp Mphb靶标序列。(2)纯化步骤(I)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含pMD18-T-#/^^i的阳性克隆子，将阳性克隆子用液体LB培养基培养，从菌液中提取pMD18-T-i^^i质粒；
(3)PMD18-T-姆酶切以获得靶标片段，酶切体系如下
Sal I :3μ1BamW I : 3Μ-1ΡΜ 18- -MpAbi 28μ110XT buffer: 6M-I在37°C下反应2小时。酶切结束后，琼脂糖凝胶回收#/ 靶标片段。(4) pUCCRNAi反向连接位点的酶切，酶切体系如下
Sal I : 4M-1
BamW I : 4M-1pUCCRNAi: 26μ110XT buffer: 6M-I在37°C下反应8小时。
·
酶切结束后，琼脂糖凝胶回收pUCCRNAi反向连接片段。(5) pUCCRNAi反向连接片段与姆7况7靶标片段连接得到pUCCRNAi_i^^-R，连接体系如下
Mphb革巴标片段6. 5μ1 pUCCRNAi反向连接片段2μ1 T4 Iigase: O. 5Μ-1 T4 ligase buffer: IM-I 在16°C下反应8小时
取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含pUCCRNAi-i^^-R的阳性克隆子；
(6) pUCCRNAi-i^^-R正向连接位点的酶切，酶切体系如下
Xho I : 4M-1Bgl II :4μ1pUCCRNAi: 28μ1IOXH buffer: 4M-1在37°C下反应8小时。酶切结束后，琼脂糖凝胶回收pUCCRNAi-i^AA-R大片段。
(8)pUCCRNAi-i^^-R大片段与姆靶标片段连接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，连接体系如下
Mphb革巴标片段6. 5μ1 pUCCRNAi-i^^-R 大片段2μ1 T4 ligase: O. 5M-1 T4 ligase buffer: IM-I 在16°C下反应8小时
取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含pUCCRNAi-i^^-F-R的阳性克隆子；
(9)pUCCRNAi-A/^F-R dsRNA表达框i^6-F-R的酶切，反应体系如下； ^CCmki-Mphb-V-R 34μ1
Pst I :2μ1IOXH buffer: 4M-1在37°C下反应2小时。酶切结束后，琼脂糖凝胶回收dsRNA表达框片段i^^-F-R。
(10)pCAMBIA2300的酶切，体系如下
PCAMBIA2300 34μ1
Pst I :2μ1
IOXH buffer: 4M-1
在37°C下反应2小时。酶切结束后，琼脂糖凝胶回收pCAMBIA2300大片段。·
(11)pCAMBIA2300欠微与MphbdsRNA表达框片段姆AA-F-R的连接得到植物表达载体 pCAMBIA2300-J^^i，体系如下
Mphb~ -R\ 6. 5M-1PCAMBIA2300 大片段2μ1T4 ligase: O. 5M-1T4 ligase buffer: IM-I在16°C下反应8小时
取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，蓝白斑筛选含PCAMBIA2300-物从i的阳性克隆子；提取质粒pCAMBIA2300-物从i，通过酶切与测序，确认载体构建正确。(12) pCAMBIA2300-物从i的酶切验证，酶切体系如下 pCAMBIA2300-i^^i 5μ1
Pst I : μ IOXH buffer: 2μ1ddH20 12μ1
在37°C下反应2小时。酶切结束后，琼脂糖凝胶检测酶切效果。如图2所示，其中M为250bp laddermarker, I号泳道为酶切后的pCAMBIA2300_J^^i，显示预期的两条带，质粒pCAMBIA2300条带与约IlOObp的dsRNA表达框i^6-F-R条带，2号泳道为未经酶切的pCAMBIA2300t^^。(12)植物表达载体pCAMBIA2300_i^^i转化根癌农杆菌
将经过酶切和测序检测的植物表达载体用冻融法转化根癌农杆菌EHA105。每支感受态细胞(100 μ I)加入pCAMBIA2300-i^^i质粒10 μ I，混匀，冰浴30 min,转入液氮冷冻5min，迅速置37°C水浴5 min。在超净台上加入I ml不含抗生素的液体YEB培养基，28°C，180 r mirf1摇床上培养4 h。将菌液5000 r mirf1离心5 min,弃去上清液,吸取100 200μ I新鲜YEB液体培养基重悬沉淀后涂布固体YEB培养基(含50 mg Γ1的利福平和50 mg卡那霉素)，于28°C下培养约两天，将长出的菌斑接种于液体YEB培养基(含50 mg L—1的利福平和50 mg L—1卡那霉素),于28°C摇床180 r mirT1培养约I天后从菌液提取质粒,通过电泳与PCR检测，确认pCAMBIA2300-姆已成功转化农杆菌。(13)转基因烟草的获得
采用叶盘转化法获得转基因烟草植株。将健康烟草叶片置于大培养皿，用75%乙醇浸泡灭菌3 min，用灭菌水冲洗3次，O. 1%升汞浸泡灭菌8分钟，用灭菌水冲洗5次。用灭菌的打孔器打孔得到叶盘。用诱导培养基(MS培养基+ O. I mg Γ1 NAA + I mg Γ1 BA + 3%蔗糖+ O. 375% phytagel，pH，5. 7)25°C暗培养叶盘3 5天。将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(5g L—1胰蛋白胨，Ig L—1酵母提取物，5 g L—1牛肉膏，5 g L—1蔗糖，O. 5g Γ1 MgSO4. 7H20, 50 mg Γ1 利福平，50 mg L—1 卡那霉素)，180 200 r mirT1，28°C下培养至0D_=0. 6 I. 0，浸染叶盘30 min。将叶盘转移到灭菌吸水纸上，吸干表面菌液后转移到共培养基(MS 培养基 + O. I mg Γ1 NAA + I mg Γ1 BA + 3% 蔗糖+ O. 375% phytagel,pH，5. 7)，25°C左右暗培养两天，将叶盘转移到分化培养基(MS培养基+0. I mg Γ1 NAA +I mg L-1 BA+ 3%鹿糖+ 500 mg L-1 头孢霉素+100 mg L-1 卡那霉素+ O. 375% phytagel,pH, 5. 7)，光照培养一个月左右，保持28 30°C，每10天更换一次分化培养基。分化出小苗后，将苗转移到生根培养基(MS培养基+ O. I mg Γ1 NAA + 3%蔗糖+ 80 mg Γ1卡那霉素+ 250 mg L—1头孢霉素+ O. 375% phytagel, pH, 5. 7),每天光照16 h。生根后将卡那霉素抗性苗移栽到土壤，繁殖到T2代。如图3所示，经愈伤组织诱导，共培养，分化，生根培养，最后得到了烟草转化子，并移栽成活。(14)转基因烟草的PCR检测针对dsRNA表达框的35S启动子区设计引物，以转·基因烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，以转化空载体的烟草为对照。引物序列如下
35SF:5’ -ACAGAACTCGCCGTAAAG-3’ (SEQ ID NO. 7)
35SR:5’ -AGTGGGATTGTGCGTCAT-3’ (SEQ ID NO. 8)
PCR条件为首先将下述试剂混合在一起，
烟草 DNA μ
脱氧核苷酸底物dNTPs 2μ1
IOXTaq DNA聚合酶缓冲液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
35SF (ΙΟμΜ) O. 4μ1
35SR (ΙΟμΜ) O. 4μ1
ddH20 14μ1
总体积20μ1
反应条件为首先94°C预变性3分钟；然后进行如下循环94°C 30秒，50°C 30秒，72 °C 45秒，共进行35循环；最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，琼脂糖凝胶检测结果。如图4所示，M DL2000 marker ;3、5、12为三个转化pCAMBIA2300-物从i的转基因株系；空白为转化PCAMBIA2300空载体的烟草；野生型为没有经过转基因处理的野生型烟草。说明Aphb dsRNA表达框序列已成功转化烟草。
转基因烟草抗蚜试验
T2代转基因烟草在4-5叶期，在烟草顶叶用毛笔每株接种10头初生烟蚜，接种后接烟草置于20X20X20 (长X宽X高)cm用纱布密封的养虫笼内，保持恒温25°C。每株转基因烟草接种10头新生若蚜，每种烟草设8个重复，第7-12天统计每日产蚜数。如图5所示，以野生型烟草(野生型)与转化空载体的烟草(空白)为对照，取食含有#/ dsRNA表达框的烟草后(株系3、5、12 )，烟蚜日产蚜数减少。
接种后第14天统计单株烟蚜头数与烟蚜总生物量。如图6所示，烟蚜取食含有 Mphb dsRNA表达框的转基因烟草后繁殖总量降低。如图7所示，烟蚜取食含有dsRNA表达框的转基因烟草后总生物量也显著降低。
权利要求
1.一种物况7基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—种#/ 基因表达的蛋白，其特征在于，其由权利要求I所述的cDNA所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种如权利要求I所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤 (O从烟蚜成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ； (2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQID NO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示； (3)以步骤(I)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段； (4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选含目的片段的阳性克隆； (5)将步骤(4)所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求I所述的cDNA。
4.一种如权利要求I所述cDNA的应用，其特征在于从权利要求I所述的cDNA序列中选取SEQ ID NO. I中第303-729位的427bp作为干涉靶标，构建合成物从dsRNA的植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化获得表达#/ dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物，烟蚜取食所述转基因植物后，烟蚜的#/ 表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，繁殖能力下降。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述植物为烟草，果树，十字花科蔬菜，瓜类或茄类。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为烟草。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于获得表达dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因烟草的方法步骤如下 (OMphbdm片段靶标序列的扩增与酶切位点的引入设计引物，扩增MphbcMk片段427bp靶标序列，在上下游分别引入I与BeuM I位点，所述弓I物正向序列如SEQ IDNO. 5所示，反向序列如SEQ ID NO. 6所示； (2)纯化步骤(I)所得PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-i^^i，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，选含pMD18_T_i^^i的阳性克隆子，培养阳性克隆子，从中提取PMD18-T-姆质粒； (3)mi^-Mphbi酶切以获得靶标片段，酶切结束后，回收#/ 靶标片段； (4)pUCCRNAi反向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi反向连接片段； (5)pUCCRNAi反向连接片段与靶标片段连接得到pUCCRNAi-i^^-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pUCCRNAi-i^^-R的阳性克隆子； (6)pUCCRNAi-i^^-R正向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi-R大片段； (8)pUCCRNAi-i^^-R大片段与姆靶标片段连接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pUCCRNAi-i^^-F-R的阳性克隆子； (9)pUCCRNAi-i^^-F-RdsRNA表达框物从-F-R的酶切，酶切结束后，回收^CCmki-Mphb-V-R dsRNA 表达框片段姆AA-F-R ； (10)pCAMBIA2300的酶切，酶切结束后，回收pCAMBIA2300大片段； (11)pCAMBIA2300大片段与Mphb dsRNA表达框片段Mphb-Y-R的连接得到植物表达载体pCAMBIA2300-i^^i，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含PCAMBIA2300-物从i的阳性克隆子；提取质粒pCAMBIA2300-物从i，通过酶切与测序，确认载体构建正确； (12)植物表达载体pCAMBIA2300-i^^i转化根癌农杆菌； (13)转基因烟草的获得 采用叶盘转化法获得转基因烟草植株，将步骤(12)含有植物表达载体PCAMBIA2300-物从i的农杆菌接种于YEB培养基培养至OD6tltl=O. 6 I. 0，浸染烟草叶盘，然后将叶盘转移到共培养基进行暗培养，再将叶盘转移到分化培养基光照培养25-35天，保持28 30°C，分化出小苗后，将苗转移到生根培养基进行培养，生根后将苗移栽到土壤，繁殖到T2代。
全文摘要
本发明公开了一种烟蚜hunchback基因的cDNA及其应用，通过将烟蚜(Myzuspersicae)胚胎发育关键基因hunchback(Mphb)cDNA转到植物中，获得表达MphbdsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物，烟蚜取食转基因烟草后，Mphb表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，日平均产蚜数减少，繁殖能力下降，从而用于烟蚜的生物防治。
文档编号C12N15/10GK102851297SQ20121025702
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者毛建军, 曾凡荣 申请人:中国农业科学院植物保护研究所