Zc3hav1基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地，设及一种ZC3HAV1基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是含有8个RNA基因组片段的负链RNA病毒。高致病性禽流感化ighly 化thogenic Avian Influenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的W禽 类为主的烈性传染病。
[0003] 水禽包括家鸭是流感病毒的天然宿主，所有16种HA和9种NA的不同组合的亚型都 能在水禽中分离。流感病毒对水禽一直保持着低致病力的特征，水禽感染病毒并不发病，但 可W向外界排毒。某些对水禽致病力低的毒株，对鸡或其他宿主则表现为高致病性。然而， 随着流感病毒的不断进化，水禽与流感病毒的平衡状态被打破。如2002年首次报道在香港 出现致死水禽的册N1亚型毒株，2005年青海湖大规模爆发册N1亚型流感病毒致死候鸟事件 等。在人群中流行的新毒株出现有多种方式:禽流感病毒或其他流感病毒与人流感病毒发 生基因重排产生感染人的流行毒株、禽流感病毒在猪体内适应后产生的流行株、禽流感病 毒传播到人产生流行毒株W及人流感病毒老毒株时隔数年后又重新流行，此外，还有人流 感病毒本身的抗原漂移等。
[0004] 总之，A型流感病毒的最大特点是宿主广泛，亚型众多，变异形式多样，发病突然， 流行性、致病性强，易诱发严重并发症，危害巨大。因此，目前在研究流感病毒的变异、进化、 流行与分布规律，提高防控流感能力的同时，也致力于鉴定新的抗流感病毒的免疫基因，解 析宿主影响流感病毒感染性、致病力W及免疫应答的分子机理研究，W提高宿主的抗病性 能及促进防控流感病毒新手段的开发。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与新的抗流感病毒的免疫基因，W及提供该基因在抗流 感病毒中的应用。
[0006] 本发明的发明人在研究中发现水禽包括家鸭是册N1亚型流感病毒的储存宿主，早 期病毒不致死水禽，感染病毒的水禽自身也不表现出明显的临床症状，随着病毒的不断进 化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。因此发明人通过研究比对感染两种亚型H5N1毒株 的北京鸭的差异基因表达寻找抗性或易感相关的基因。从而发现并提供了一种鸭的 ZC3HAV1基因，所述ZC3HAV1基因具有：
[0007] a)SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列;或
[000引b)SEQ ID No. 1所示核巧酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核巧酸所获得 的具有同等功能的由a)衍生的核巧酸序列。
[0009] 本发明还提供了所述的ZC3HAV1基因所编码的氨基酸序列。
[0010] 本发明还提供了含有所述ZC3HAV1基因的载体。
[0011]优选的，所述载体为导入ZC3HAV1基因 CDS序列后获得的PiggyBac-ZC3HAVl载体。 [0012]本发明还提供了含有所述的ZC3HAV1基因的转基因细胞。
[0013] 所述转基因细胞可W为禽类细胞或哺乳动物细胞。
[0014] 优选的，所述转基因细胞为鸡胚成纤维永生化细胞系DF1。
[001引本发明还提供了所述的ZC3HAV1基因在影响流感病毒复制中的应用。
[0016] 可选的，所述流感病毒包括册N1型AIV病毒，例如可W为低致病力的毒株GS/65(A/ goose/Hubei/65/05)和高致病力的毒株 DK/49(A/duck/Hubei/49/05)。
[0017] 可选的，所述应用包括通过ZC3HAV1基因在细胞中的过表达来抑制AIV病毒在细胞 中的复制，W及在敲除ZC3HAV1的细胞中AIV病毒的复制显著增加。
[0018] 本发明还提供了一种转基因动物的构建方法，所述方法包括在动物细胞转入本发 明所述的ZC3HAV1基因。
[0019] 本发明所述ZC3HAV1基因可用于制备抗流感病毒的转基因动物，此外，敲除 ZC3HAV1基因的细胞系可W作为AIV等病毒疫苗生产的工具细胞。
[0020] 本发明所提供的ZC3HAV1基因可用于抑制流感病毒，特别是可W显著抑制AIV病毒 的复制，因此可W针对鸭ZC3HAV1基因进行深入的功能研究，从而确定其抗AIV病毒的关键 蛋白结构域或氨基酸。利用转基因技术等基因编辑方法，获得可诱导性高表达ZC3HAV1基因 的转基因畜禽，培育出抗AIV等多种类型病毒的转基因农业动物优良品种。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中利用转录组数据分析得到的鸭ZC3HAV1基因 mRNA序列。
[0022] 图2为本发明实施例3中所述载体PiggyBac的图谱，其中X gene为ZC3HAV1。
[002；3]图3为本发明实施例4、5中瞬时转染ZC3HAV1W及阴性对照质粒24h后DF1细胞的镜 下观察结果。
[0024] 图4为本发明实施例4、5中瞬时转染ZC3HAVm及阴性对照质粒4她后，收取细胞总 蛋白后对ZC3HAV1基因的过表达效果的Western blot验证。
[0025] 图5为本发明实施例4、5中在DF1细胞中过表达ZC3HAV1基因，抑制实施例6中流感 病毒DK/49 (左）和GS/65 (右）的复制。
[0026] 图6为本发明实施例4、5中DF1细胞感染流感病毒AIV(DK/49)4化后，内源ZC3HAV1 基因 mRNA的表达变化，WGAPDH基因作为内参。
[0027] 图7为本发明实施例4、5中细胞过表达ZC3HAV1基因前后，感染流感病毒AIV(DK/ 49)后，病毒不同形式RNA的相对表达变化，WGAPDH基因作为内参。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0029] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0030] 若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (New 化rk:Gold Spring 化rbor LaboratoiT Press, 1989)，或按照制造厂商说明书建议 的条件。
[0031] 实施例1
[0032] 利用分析转录组数据发现新的抗AIV感染的基因 ZC3HAV1。
[0033] 水禽包括家鸭是册N1亚型流感病毒的天然宿主，其感染部分册N1亚型病毒后，不 表现出明显的临床症状。随着病毒的不断进化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。本研究 选取两种H5N1亚型毒株（即高致病性的A/duck/Hubei/49/05(DK/49)及低致病性的A/ gooseMubei/65/05(GS/65)册N1病毒），感染4周龄绍兴麻鸭。通过高通量测序的方法，分别 构建感染DK/49或GS/65册N1流感病毒后1天、2天和3天鸭的W及对照组鸭的脾脏、脑和肺组 织基因表达图谱，鉴定参与机体抗流感病毒相关的免疫基因，为禽流感的治疗和预防提供 新办法。
[0034] 前期用DK/49或GS/65H5N1病毒感染4周龄绍兴麻鸭，分别在感染AIV后1、2和3天 后，取脾脏、脑和肺组织样，提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析。分析发 现:与对照组相比较，无论是在感染DK/49或GS/65册N1病毒后1、2和3天的脾脏、脑和肺组织 中，ZC3HAV1的表达量均极显著升高（如图1所示，分别在两株册N1毒株(A/duck/Hubei/49/ 05，DK/49，高致病)和(A/goose/Hubei/65/05，GS/65，低致病），感染4周龄绍兴鸭后的第1、 第2和第3天脾脏、肺和脑组织中的表达模式；横坐标代表时间点，纵坐标代表相对表达 量。）。
[0035] 实施例2
[0036] 利用分子生物学实验方法获得鸭ZC3HAV1基因全长编码区序列。
[0037] 参照Ensemble网站上的鸭基因组参考序列，并根据转录组拼接序列，设计鸭 ZC3HAV1基因全长CDS区克隆引物ZF/ZR，序列如下：
[0038] ZF:5，-ATGAGCGACC CGGTGGTGTG CAGCT-3,，
[0039] ZR:5'-GGGCTACAAA CAGCTCTGAT CACTT-3'。
[0040] W鸭脾脏组织cDNA为模板，利用肥B公司的Q5高保真聚合酶进行PCR扩增，扩增产 物经胶回收后连接到T载体上进行测序。序列比对分析后发现：鸭ZC3HAV1基因全长编码区 为215469(569 10^.1)，共编码717个氨基酸(569 10^.2)。
[0041] 本发明人成功克隆得到鸭ZC3HAV1基因全长编码区序列。
[0042] 实施例3
[0043] 利用细胞学实验方法在细胞中瞬时过表达ZC3HAV1基因
[0044] 1、鸭ZC3HAV1基因过表达载体的构建
[0045] 根据鸭ZC3HAV1基因编码区序列，设计其真核表达载体引物eZF/eZR，上、下游引物 都是分别引入Mlu巧阳me I酶切位点（下划线标注）；此外，上游引物在起始密码子ATG之前 引入kozak(粗体标注)序列，在目的基因 C末端引入flag标签(粗体标注）。引物序列如下：
[0046] eZF：
[0047] 5，-GACGCGTGCCACCATGAGCGACCCGGTGGTGTGCA