专利名称：Exo1基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种EXOl基因的用途。
背景技术：
EXOl基因(又名HEX1，NM_003686)位于染色体lq42_43区段，编码92KD蛋白，属于RAD2蛋白家族，包含RAD2保守结构域，功能上具有5’ -3’ DNA外切酶活性和RNase H活性。其同源蛋白Exol在线虫中与DNA错配修复相关蛋白Msh2互作，并参与DNA错配重组修复过程。EXOl被发现在细胞分裂S期与增殖细胞核抗原PCNA共定位于细胞核，提示其既可能作为结构特异性核酸酶FENl的同工酶去除RNA模板，也可能通过参与DNA错配修复的重合成及重合成前步骤来实现其在DNA修复过程中的作用。DNA错配修复被认为是维持基因组完整性的重要机制，相关通路的失活是导致肿瘤发生的原因之一，如hMSH2，hMSH6，hMLHl和hPMS2等基因突变会导致遗传性非肌肉病性结直肠癌(HNPCC)，提示参与此过程的相关蛋白可能在肿瘤发生过程中发挥重要作用。在非典型HNPCC中，一些EXOl基因突变，如V27A，E109K, L410R，和P770L被发现特异性地出现在病人组样本中。此外，EXOl基因的R354H、E670G位点的多态性则被分别认为与胰腺癌和肺癌病人的预后相关。目前尚没有关于EXOl基因作为肝癌诊断标志物的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供 一种EXOl基因的用途，EXOl基因可作为诊断肝癌的分子标志物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:在本发明的一个方面，提供了一种EXOl基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。优选的，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增EXOl基因的引物。所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括:与EXOl基因的核酸序列杂交的探针。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与EXOl蛋白特异性结合的抗体。在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对EXOl基因的引物或探针，或包含特异性结合EXOl蛋白的抗体。利用本发明的试剂盒，可以检测病人EXOl基因的表达情况，从而诊断病人是否患有肝癌。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15 25个核苷酸之间。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对EXOl蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人EXOl基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与EXOl蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样，表达人EXOl蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。经实验证明，本发明EXOl基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此EXOl基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1的EXOl基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的半定量RT-PCR结果图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。实施例1用半定量RT-PCR方法检测肝癌样本中EXOl基因的表达变化半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。运用半定量RT-PCR方法，检测20对肝癌样本中EXOl基因的表达变化，发现其在肝癌组织中呈明显的上调表达趋势。具体实验步骤如下:1.组织分离实验用组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2.RNA 抽提采用TAKARA公司的Trizol (D9108)对20对肝癌样本(癌和癌旁)组织进行抽提，并用安捷伦2100对产物的纯度和浓度进行检测。具体操作是:将碾杵和匀浆器等器皿在200°C干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾 成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzoI试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4°C离心沉淀RNA ;用75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)，结果见下表I。质量鉴定好的RNA存放在_80°C冰箱待用。表I 20对肝癌样本的RNA抽提质量检测结果
权利要求
1.一种EXOl基因的用途，其特征在于，用于制备诊断肝癌的产品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增EXOl基因的引物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括■ 与EXOl基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与EXOl蛋白特异性结合的抗体。
6.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对EXOl基因的引物对。
7.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对EXOl基因的探针。
8.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合EXOl蛋白的抗体。
全文摘要
本发明公开一种EXO1基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。本发明还公开了一种用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含特异性针对EXO1基因的引物或探针，或包含特异性结合EXO1蛋白的抗体。本发明的EXO1基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
文档编号C12Q1/68GK103173528SQ201110436930
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者黄健, 刘星 申请人:上海生物芯片有限公司