一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状分子标记gga-miR-1662及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记 gga-miR-1662及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠炎沙口氏菌（Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性 致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过家禽副产品给人类的健康带来 很大的威胁。运种病菌主要是通过动物性产品包括禽肉，鸡蛋和奶类及奶制品等导致人中 毒甚至死亡。因此如何获得抗性高的遗传个体成为亟待解决的问题之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，与祀基因3'UTR(非翻译 区）结合在转录后水平调控祀基因的表达，在细胞增殖、分化、调亡、神经发育、脂肪代谢等 多个生物学过程中发挥重要作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记gga-miR-1662及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1662，发明人经过研究发现，gga-miR-1662可W通过调控TLR1LA基因的表达调控 肠炎沙口氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙口氏菌感染抗性检测的分子 标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
[0005] 发明人提供的具体技术方案如下：
[0006] 发明人首先提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记，该抗性分子标记为鸡 miRNA gga-miR-1662,其核巧酸序列如沈Q ID NO: 1所示；
[0007] 发明人进一步给出了该分子标记的检测方法如下：
[000引 gga-miR-1662的表达量检测
[0009] miRNA反转录
[0010] 用One St邱PivimeS.cript麽miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20化(具体见表1)。反应程序为:37°C，60min;85°C， 5s;反应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0011] 表1 miRNA反转录体系（20yL)
[0012]
[0013]其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0014] gga-miR-1662 巧光定量 PCR
[0015] 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所 /J、- 〇
[0016] 表2 miRNA定量检测引物
[0017]
[0019] 其中〉gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer选用试剂盒中自带引物；
[0020] 巧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复Ξ 次。WU6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0021] 表3巧光定量PCR体系（2化L)
[0022]
[0023] 发明人为了验证上述gga-miR-1662的功能采用了祀基因检测的方式，利用 TargetScan及miRanda等软件预测到TLR1LA是gga-miR-1662的祀基因。结果发现通过分别 比较肠炎沙口氏菌感染组与未感染组中miRNA与祀基因的调控方向，可知gga-miR-1662在 感染组中显著下调，祀基因化R1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组(如图1所示），即 gga-miR-1662与化R1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可W通过 调控化R1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙 口氏菌感染抗性检测的分子标记。
[0024] 综上所述，本发明提供了一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记及其检测方法， 该抗性分子标记为鸡gga-miR-1662，发明人经过研究发现，gga-miR-1662可W通过调控 化R1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙口氏 菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种 奠定基础。
【附图说明】
[00巧]图1为gga-miR-1662与祀基因化RILA在感染组相对未感染组中的表达差异倍数柱 状图，
[00%]由图可知，gga-miR-1662在感染组中显著下调，TLR1LA在感染组中的表达量显著 高于未感染组，即gga-miR-1662与TLR1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga- miR-1662可W通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0028] 实施例1
[0029] gga-miR-1662的表达量检测
[0030] miRNA 反转录
[0031 ]用One St邱'PrlmeSc.ri:pt'?miRNA cDNA Synthesis Kit(F*e;rfect Real Time)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20化(表1)。反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反 应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0032] 表1 miRNA反转录体系（20yL) Γ00331
[0034] 其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0035] gga-miR-1662 巧光定量 PCR
[0036] 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所 /J、- 〇
[0037] 表2 miRNA定量检测引物 [00；3 引
[0039] 其中〉gga-miR-1662和U6分别作为Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer选用试剂盒中自带引物；
[0040] 巧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复Ξ 次。WU6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0041 ] 表3巧光定量PCR体系（20μυ
[0042]
[0043] 实施例2
[0044] 祀基因 TLRILA的表达量检测
[0045] mRNA反转录
[0046] 根据试剂盒说明书要求，利用TaKaRa Primer ScriptTM RT reagent kit (Perfect Real Time)试剂盒将mRNA反转录为cDNA，放在-20°C保存备用。反转录体系如表4 所示。反转录步骤:37°C，15min;85°C，5s。
[0047] 表4反转录体系 [004引
[0049] TLR1LA 巧光定量 PCR
[00加]根据NCBI数据库mRNA序列（登录号:NM_001007488)，用Primer Premie巧.0设计巧 光定量PCR引物(表5所示），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0051]表5引物序列
[0化2]
[0053] 采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SY服Premix Ex TaqTM说明书，在 Stratagene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系为20化(表6):SYBR Primer Ex TaqTM(2 X)ΙΟμΙ,Forward Primer(10μΜ)0.4μ1,Reverse Primer(10μΜ)0.4μ1,ROX Ref erence Dye Π (50 X )0.4化，cDNA模板化L，灭菌双蒸水（d地2〇)6.祉L，终体积20化。反 应程序为两步法:95°C预变性30s，PCR反应为:95°C，5s; 60°C，30s;循环40次;添加溶解曲 线:95°C，Imin;ere，30s;95°C，30s;每个样品重复3次。Wf3-act in作为内参，用2^AGt方法 来计算mRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分析对mRNA表达量差异进行分析。
[0054] 表6巧光定量PCR体系
[0化5]
[0056] 实施例3
[0057]鸡接种肠炎沙口氏菌试验
[005引将沙口氏菌阴性白来航蛋鸡分为感染组与未感染组，感染组每只鸡接种5.8 X 108CRJ肠炎沙口氏菌，未感染组接种憐酸盐缓冲液(PBS)，接种后第7天采集盲肠组织样品。 按照使用说明，用Trizol法提取盲肠总RNA。
[0059] gga-miR-1662与肠炎沙口氏菌感染的相关性分析
[0060] 利用实施例1所述方法，检测肠炎沙口氏菌感染后盲肠组织gga-miR-1662表达变 化。定量结果显示，gga-miR-1662在感染组盲肠中的表达量显著低于未感染组（Fold change = -2.44)。说明gga-miR-1662与肠炎沙口氏菌感染具有较强的相关性。
[0061 ] TLR1LA与肠炎沙口氏菌感染的相关性分析
[0062] 利用实施例2所述方法，检测盲肠化R1LA表达与肠炎沙口氏菌感染的相关性。结果 显示，感染组化R1LA的表达量显著高于未感染组，是未感染组的1.55倍（P<0.05)。说明 TLR1LA与鸡肠炎沙口氏菌感染相关。
[0063] gga-miR-1662与其祀基因 TLR1LA的互作分析
[0064] 通过分别比较感染组与未感染组中miRNA与祀基因的调控方向，可知gga-miR- 1662在感染组中显著下调，TLR1LA在感染组中的表达量显著高于未感染组(如图1)，即gga- miR-1662与化R1LA调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1662可W通过调控 化R1LA基因的表达调控肠炎沙口氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1662可W作为肠炎沙口氏 菌感染抗性检测的分子标记。
【主权项】
1. 一种鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR- 1662,其核巧酸序列如沈Q ID NO: 1所示。2. 权利要求1所述鸡肠炎沙口氏菌感染抗性分子标记检测方法，具体步骤如下： gga-miR-1662的表达量检测 miRNA反转录 用One St邱时.imeScri.p:愧'miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)试剂盒， 严格按说明书进行;反转录体系为20化，如表1所示;反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反 应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用； 表1 miRNA反转录体系gga-miR-1662 巧光定量 PCR 根据gga-miR-1662成熟序列设计引物，如表2所示；利用所设引物，采用SYBR Green I 染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stra化gene MX3000P巧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所示； 表2 miRNA定量检测引物巧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40个循 环;最后添加溶解曲线(95°(31111111，62°03〇3,95°03〇3)，1个循环，每个〇0臟样品重复^次；^ U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分 析对gga-miR-1662表达量差异进行分析。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA？gga-miR-1662，发明人经过研究发现，gga-miR-1662可以通过调控TLR1LA基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1662可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN105543227
【申请号】CN201610015399
【发明人】李显耀, 吴桂贤, 刘丽英, 刘肖意
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月11日