与控制黄瓜表皮毛/果刺起始基因Tril紧密连锁的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域的分子标记，特别设及两个与控制黄瓜表皮毛/果 刺起始基因化i 1紧密连锁的分子标记。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis sativus L.)是葫芦科（Cucurbi1:aceae)黄瓜属（Cucumis) -年蔓 生的草本植物，黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。黄瓜 植株被覆表皮毛，表皮毛可有效防止食草动物和昆虫的哨食、抵抗病原菌的侵害、减轻阳光 直射(包括紫外光)的伤害、减慢蒸腾作用、调节植物吸收的水分和养分、降低表面的机械损 伤和表面溫度等，使植物更加适应生长环境。黄瓜的果实属于辄果，是经济性状最重要的部 分，由子房和花托共同发育而成。果刺是表皮毛在果实上的形态高度特化，也是重要的果实 性状。关于黄瓜果刺的研究报道，最早可追述到1997年，华北类型黄瓜地方品种"大青把"自 交后代的微毛自然突变体被发现，其表现为叶片光滑无果刺，通过高倍电镜观察茎、叶、專 片、果实表面均覆盖肉眼难察觉的微毛，并被命名为"glabrous(gl)"。通过遗传分析发现， 该微毛基因为隐性突变，基因随后被进一步克隆和分子验证。随后发现欧洲溫室黄瓜类型 的自然突变体，该突变体表现为茎、枝、叶、卷须、花瓣、專片及子房表面均光滑无表皮毛，果 实无刺无瘤且有蜡质光泽，通过电镜扫描观察发现植株表面无任何形态的表皮毛，被命名 为"化；[证0111日-1日33(化；[1)"，控制表皮毛/果刺起始的关键基因被命名为化；[1。通过遗传分 析，发现有表皮毛/果刺的野生性状(Tril)为显性，无表皮毛/果刺的突变体性状(tril)为 隐性。通过对tril突变植株的转录组分析，获得编码参与多细胞表皮毛发育和果刺发育机 制的关键转录因子，但是没有对控制表皮毛和果刺有无的关键候选基因进行进一步的定位 和分析。
[0003] 图位克隆(Map-based cloning)，可在基因产物未知的情况下，利用分离群体的遗 传连锁分析或染色体的异常，将目的基因定位到染色体的一个具体位置，找到与其紧密连 锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆基因。最常用的标记筛选方法是分离体分组混 合分析法(Bulked segregant analysis，BSA)，该方法在一对具有目的基因表型差异的亲 本所构建的分离群体中，根据目的基因的表型，分别选取相同数量的个体，构成两个亚群， 将每个亚群中个体的DNA等量混合，形成两个相对性状的"基因池"，然后用合适的分子标记 对两个基因池进行分析，在两池间表现出多态性的分子标记与目的基因座位相连锁，再利 用分离群体进一步检测所得分子标记与目的基因的连锁程度，从而确定其在已知分子图谱 或染色体上的位置。由于构建基因池使用了特定的分离群体，且在分组时仅对目的基因表 型进行选择，运样保证了其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在 目的基因区段存在差异，排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。和目的 基因有紧密连锁的分子标记具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选 择，加快育种的进程。
[0004] 随着人们生活水平的提高，黄瓜品质育种已提上日程。黄瓜果刺性状属于果实感 观品质范畴。欧洲溫室类型的黄瓜为无果刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄 瓜的2-3倍。无果刺的黄瓜果实外观光滑、机械伤口少、残留污染少、清洗方便、食用卫生、是 无公害蔬菜的理想品种。经检测表明：无果刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27%，果皮 农药残留量低18%。黄瓜果刺基因化il控制果刺的有无，它的研究将会推动黄瓜品质育种 进程。利用和果刺紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的 方法。稳定遗传的突变体tril为黄瓜果刺形成机理研究提供了理想的材料，其和有刺亲本 的Fi群体表现为少刺，为黄瓜培育少刺优良新品种提供了稳定的无果刺亲本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，在于提供两个与控制黄瓜表皮毛/果刺起始基因化il紧密连锁的 分子标记。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 与控制黄瓜表皮毛/果刺起始基因 Tril紧密连锁的分子标记，命名为FlankT-01， 由沈Q ID NO. 1所示的DM片段和沈Q ID NO.2所示的DNA片段组成；其中，SEQ ID NO. 1所示 的DNA片段与有表皮毛/果刺基因化il连锁，SEQ ID ^).2所示的0魁片段与无表皮毛/果刺 基因 tril连锁。
[000引所述FlankT-01由SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩 增得到，其扩增程序为:94°C5分钟;94°C30秒，57°C30秒，72°C30秒，35个循环;72°C5分钟。
[0009] 与控制黄瓜表皮毛/果刺起始基因 Tril紧密连锁的分子标记，命名为FlankT-02， 由序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段组成;其中，SEQ ID NO.3所示的DNA片段与有表皮毛/果刺基因化il连锁，SEQ ID NO.4所示的DNA片段与无表皮 毛/果刺基因 tril连锁。
[0010] 所述尸1曰证1'-02由569 10^).7所示的上游引物和569 10^.8所示的下游引物扩 增得到，其扩增程序为:94°C5分钟;94°C30秒，57°C30秒，72°C30秒，35个循环;72°C5分钟。
[0011] 上述引物由上海生工合成。
[0012] 本发明利用微毛突变体gl和无表皮毛/果刺突变体tril杂交的1058株F2分离群 体，通过表型分析确定了黄瓜表皮毛/果刺有无性状和微毛性状为非等位基因，且有表皮 毛/果刺性状属于单基因控制的显性性状。后分别取F2分离群体每株嫩叶提取基因组DNA， 结合BSA法筛选与化il基因紧密连锁的分子标记。利用高密度图谱分子标记，最终提供两个 与黄瓜表皮毛/果刺基因化il紧密连锁的标记，分别座落在化il基因两侧，两标记遗传距离 仅37.4肺，且两个分子标记之间的物理图谱有利于Tril基因的最终克隆，便于有无表皮毛/ 果刺的分子标记辅助育种体系建立。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用与育种 实践中。
【附图说明】
[0013] 图1显示SSR标记FlankT-0巧日FlankT-02和控制表皮毛/果刺起始基因 Tril紧密连 锁；
[0014] 图2显示SSR标记Fla址T-01 F2群体PCR扩增条带；
[0015] 图3显示SSR标记Fla址T-02 F2群体PCR扩增条带。
【具体实施方式】
[0016] -、F2分离群体