一种快速提取植物组织总rna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种快速提取植物组织总RNA的方法。
【背景技术】
[0002] 从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行基因克隆，基因表达调控等植物 分子生物学研究的必要前提;在提取RNA的过程中，不仅会受到RNase的污染，同时也会受到 植物组织中丰富的糖类、多酪，蛋白质等物质的干扰，从而造成分离的RNA杂质多，纯度低， 难W达到后续实验的要求；目前大多数植物组织中提取RNA的方法用时过长，工作效率低 下，而TRIZ0L等商业试剂盒，虽然快速，但是成本较高，其质量和效果也不稳定。
【发明内容】
[0003] 针对于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种快速提取植物组织 总RNA的方法，该方法提取的RNA纯度高，提取时间短，大大提高了工作效率。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 提供一种快速提取植物组织总RNA的方法，包括W下步骤：
[0006] 1)研鉢洗净后，用酒精进行灼烧，再用液氮迅速预冷，将交联聚乙締基化咯烧酬和 植物组织按照1:1~l:5(w/w)的比例置于上述研鉢中，并在液氮中研磨成粉末;取0.1-0.3g 左右的上述粉末置于2ml离屯、管中，加入ΙΟμΙβ-琉基乙醇和1ml预热CTAB提取液，震荡混匀， 于55-68°C下水浴20-30分钟，冷却至室溫；
[0007] 2)在步骤1)所述的离屯、管中直接加入1ml氯仿，充分震荡后，常溫下，12000rpm离 屯、5min;取上清，加入等体积氯仿，充分震荡后，4°C，12000巧m离屯、lOmin，取上清，按照同样 的条件重复抽提一次；
[000引 3)取上清，加入等体积8M LiCl，常溫下沉淀1-化，12000巧m离屯、lOmin，彻底弃上 清，保留沉淀；
[0009] 4)在上述沉淀中加入75%乙醇浸泡5-lOmin，上下颠倒洗涂，8000巧m离屯、5min，彻 底弃上清，重复洗涂1-2次，所得沉淀于室溫下风干10-15min(不要有酒精残留），再加入20- 30μ1 DEPC处理水溶解，-20°C保存。
[0010] 所述交联聚乙締基化咯烧酬和植物组织的质量比为1: l(w/w)。
[0011] 所述植物组织为植物的根、茎、叶、花、果实或种子。
[0012] 所述CTAB提取液配方为：3%CTAB，2%PVP，200mMTris-肥l(抑8.0)，50mMEDTA， 1.4M NaCl。
[0013] 本发明首先将研鉢用酒精烧后并用液氮快速预冷，加入特定比例的交联聚乙締基 化咯烧酬和植物组织于研鉢中，用液氮充分研磨后，再加入预热的CTAB提取液和β-琉基乙 醇进行细胞裂解，然后经氯仿抽提，用等体积的高浓度LiCl快速沉淀得到总RNA。该方法能 够有效控制RNase对RNA的降解、酪类物质W及多糖的干扰，制得高纯度的RNA，并且用时短， 成本低，效率高，所提取的RNA纯度和完整性高，能够满足对高纯度的RNA的需求，具有巨大 的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为采用本发明实施例1的方法提取草替不同组织总RNA的凝胶电泳图；
[0015] 图2为使用本发明实施例1提取的总RNA为模板扩增草替Actin基因的PCR凝胶电泳 图；
[0016] 图3为使用本发明实施例2的方法提取黑替、草替、相橘、雜猴桃总RNA的凝胶电泳 图。
[0017] 图4为使用本发明实施例2的方法提取月季、唐富蒲和芥蓝总RNA的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0018] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及 相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
[0019]实施例1
[0020] 将研鉢洗净，用酒精进行灼烧，然后液氮迅速冷却，加入0.2g的交联聚乙締基化咯 烧酬和0.2g草替叶片，在液氮环境中研磨成粉末；
[0021] 取O.llg上述研磨的粉末，放置于2ml离屯、管中，加入ΙΟμΙβ-琉基乙醇和1ml预热好 的CTAB提取液，震荡混匀，于65°C下水浴20-30分钟，冷却至室溫；
[0022] 在上述离屯、管中再加入1ml氯仿，充分震荡后，常溫下，12000巧m离屯、5min;取上 清，加入等体积氯仿，充分震荡后，4°C，12000rpm离屯、lOmin;取上清，加入等体积氯仿，充分 震荡后，4°C，12000巧m离屯、lOmin;
[0023] 取上清，加入等体积8M LiCl，常溫下沉淀化，12000巧m离屯、lOmin，彻底弃上清，得 到沉淀；
[0024] 在上述沉淀中加入75 %乙醇浸泡5min，上下颠倒洗涂，800化pm离屯、5min，彻底弃 上清，按照同样的条件重复洗涂2次，所得沉淀于室溫下风干15min，再加入20ul DEPC处理 水溶解，于-20°C下保存使用。
[0025] 实施例2
[0026] 采用的植物组织分别为草替的茎、花、果实和种子，提取步骤同实施例1，提取的总 RNA分别为茎总RNA、花总RNA、果实总RNA和种子总RNA。
[0027] 实施例3
[00%]将研鉢洗净，用酒精进行灼烧，再用液氮迅速冷却，加入0.2g的交联聚乙締基化咯 烧酬和Ig黑替果实，在液氮环境中研磨成粉末；
[00巧]取0.2：3g上述研磨的粉末，放置于2ml离屯、管中，加入ΙΟιιΙβ-琉基乙醇和1ml预热好 的CTAB提取液，震荡混匀，于60°C下水浴20-30分钟，冷却至室溫；
[0030] 在上述离屯、管中再加入1ml氯仿，充分震荡后，常溫下，12000巧m离屯、5min;取上 清，加入等体积氯仿充分震荡后，4°C，12000rpm离屯、lOmin;取上清，加入等体积氯仿充分震 荡后，4°C，12000巧 m 离屯、lOmin;
[0031] 取上清，加入等体积8M LiCl，常溫下沉淀化，12000巧m离屯、lOmin，彻底弃上清，得 到沉淀；
[0032] 在上述沉淀中加入75%乙醇浸泡lOmin，上下颠倒洗涂，800化pm离屯、5min，彻底弃 上清，按照同样的条件重复洗涂2次，所得沉淀于室溫下风干lOmin，再加入20ul DEPC水溶 解，制得，于-20°C下保存使用。
[0033] 实施例4
[0034] 采用的植物组织分别为草替果实、相橘叶片、雜猴桃叶片、月季花瓣、唐富蒲种球 和芥蓝种子，提取步骤同实施例3,提取的总RNA分别为草替总RNA、相橘总RNA、雜猴桃总 RNA、月季花总RNA、唐富蒲总RNA和芥蓝总RNA。
[0035] 取实施例1-2提取的草替不同组织的总RNA，用紫外分光光度计检测其0D值(如下 表1所示），结果表明：提取的总3麻的浓度较高，00260/00280的比值在1.92-2.08之间， 0D260/0D230的比值在1.91-2.16之间，说明从不同植物的不同组织中提取的总RNA的质量 较高。
[0036] 用1%琼脂糖凝胶对上述总RNA进行电泳检测，如图1所示，结果表明：RNA条带清 晰，完整性较好，28S条带的亮度是18S的2倍，并且几乎没有DNA的污染;在图1中，1、根；2、 茎;3、叶;4、花;5、果实;6、种子。
[0037] 将上述提取的RNA经反转录后用1对Actin引物（5'-TGGGTTTGCTGGAGATGA-3' ；5'- CAGTTAGGAGAACTGGGTG-3 '）进行PCR扩增，获得预期的目标条带，如图2所示;在图2中，1、根； 2、茎;3、叶;4、花;5、果实;6、种子。
[003引表1草替不同组织RNA提取的0D值检测
[0039]
[0040] 取实施例3-4提取的不同植物的不同组织的总RNA，用紫外分光光度计检测其0D值 (如下表2所示），结果表明：提取的总RNA的浓度较高，0D260/0D280的比值在1.90-2.06之 间，0D260/0D230的比值在1.94-2.15之间，说明从黑替、草替、相橘、雜猴桃、月季、唐富蒲和 芥蓝等不同植物的不同组织中提取的总RNA的质量较高。
[OOW 用1 %琼脂糖凝胶对上述总RNA进行电泳检测，如图3、图4所示，结果表明：RNA条带 清晰，完整性较好，28S条带的亮度是18S的2倍，并且几乎没有DNA的污染;在图3中，1、黑替； 2、草替;3、相橘;4、雜猴桃;在图4中，1、月季;2、唐富蒲;3、芥蓝。
[0042] 表2不同植物组织RNA提取的0D值检测
[0043]
[0044]从上述几个实施例的结果可W看出，用本发明方法所提取的草替不同组织RNA及 其他植物不同组织的RNA较纯净，DNA和蛋白质多糖等污染不严重，同时RNA条带比较清晰， 完整性较好，并可W用于后续克隆及定量等实验。
【主权项】
1. 一种快速提取植物组织总RNA的方法，其特征是，包括以下步骤： 1) 研钵洗净后，用酒精灼烧研钵，然后用液氮迅速预冷，将交联聚乙烯基吡咯烷酮 (PVPP)和植物组织按照1:1~l:5(w/w)的比例置于上述研钵中，并用液氮研磨成粉末；取 0.1-0.3 g的上述粉末置于2ml离心管中，加入ΙΟμΙ β-巯基乙醇和lml预热CTAB提取液，震 荡混匀，于55-68°C下水浴20-30分钟，冷却至室温； 2) 在步骤1)所述的离心管中直接加入lml氯仿，充分震荡后，常温下，12000rpm离心 5min;取上清，加入等体积氯仿，充分震荡后，4°C，12000rpm离心10min，取上清，按照同样的 条件重复抽提一次； 3) 取上清，加入等体积8M LiCl，常温下沉淀1-2h，12000rpm离心10min，彻底弃上清，保 留沉淀； 4) 在上述沉淀中加入75%乙醇浸泡5-10min，上下颠倒洗涤，8000rpm离心5min，彻底弃 上清，重复洗涤1-2次，所得沉淀于室温下风干10_15min至无酒精残留，再加入20-30μ1 DEPC处理水溶解，-20°C保存。2. 根据权利要求1所述的快速提取植物组织总RNA的方法，其特征是，所述交联聚乙烯 基吡咯烷酮和植物组织的质量比为1: l(w/w)。3. 根据权利要求1所述的快速提取植物组织总RNA的方法，其特征是，所述植物组织为 植物的根、茎、叶、花、果实或种子。4. 根据权利要求1所述的快速提取植物组织总RNA的方法，其特征是，所述CTAB提取液 配方为： 3%CTAB，2%PVP，200mM Tris-HCl (pH 8.0)，50mM EDTA，1.4M NaCl。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速提取植物组织总RNA的方法，包括：研钵用酒精烧后并用液氮快速预冷，加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和植物组织于研钵中，用液氮充分研磨后，再加入预热的CTAB提取液和巯基乙醇进行细胞裂解，然后经氯仿抽提，用等体积的高浓度LiCl快速沉淀得到总RNA。该方法能够有效地控制RNase对RNA的降解、酚类物质以及多糖的干扰，并且用时较短，成本较低、效率高，且所提取的RNA纯度和完整性好，能够满足对高纯度的RNA的需求，具有巨大的应用前景。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105543216
【申请号】CN201610116464
【发明人】汤浩茹, 张云婷, 江雷雨, 陈清, 张勇, 罗娅, 孙勃, 王小蓉, 陈品文, 冯琛, 叶云天, 宋霞
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月2日