从脂肪组织提取内皮细胞的方法

专利名称：：从脂肪组织提取内皮细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及细胞培养和纯化领域。特别地，本发明涉及内皮细胞培养和纯化。
背景技术：
：对于细胞治疗和组织工程中的许多应用，需要从患者组织获得内皮细胞，用于移植回同一个患者。为了使操作成本降到最小，以及使内皮细胞在培养期间任何可能发生的变化减到最小，在几小时内迅速分离大量的内皮细胞是有利的。为了使这种内皮细胞实际上有用，通常需要获得大量的细胞(如，大于1百万)，并且需要得到相当高纯度的分离细胞(如，大于90%的内皮同一性)。此外，期望将分离时间减到最少，这提高细胞存活力并且增加应用便利性。搭桥手术(旁路手术，bypasssurgery)是冠脉疾病和外周血管疾病的常用治疗方法，冠脉疾病和外周血管疾病在美国和欧洲都是死亡率的最大原因(1，2)。在2004年，进行了427,000台冠状动脉搭桥手术(2)。在搭桥手术中自体静脉移植物的开放性优于人工移植物(prostheticgraft)的开放性；然而，达30%的患者不具有用于搭桥术的合适静脉。在这些患者中，使用小直径的人工移植物，其导致相当高的失败率。人工移植物和自体静脉移植物之间开放性的巨大差异可能部分地归因于人工移植物的腔表面上缺乏防止血栓形成的内皮细胞(EC)(3，4)。因此，开发在人工血管移植物上成功接种EC的策略将最可能提高对这些移植物观测的开放性。EC接种(ECseeding)可以以单阶段或两阶段程序进行(5)。两阶段接种涉及有限的EC在体外的扩增，其可能需要4-5周(6)，因此，它对于紧急患者护理是不合适的。此外，EC的体外扩增需要高成本的GLP设备。单阶段接种是分离大量的EC并且随后立即接种在人工移植物上。几个研究者已经尝试开发单阶段接种程序(5)。已报道脂肪组织含有丰富的、容易获得的微血管内皮细胞(MVEC)(7，8)。在动物模型中，带有脂肪来源的EC的接种的血管移植物具有增强的开放性(9-ll)，然而，在人类中的临床试验结果是令人失望的(12，13)。原因可能是人类不同于犬科动物，缺乏自我内皮化(sdf-endotheliazation)能力。此外，分离自脂肪组织的污染的非内皮细胞促进内膜增生(14-17)。因此，找到分离大量高纯度EC的快速且稳定的方法，对于小直径人工移植物植入的成功是至关重要的。—般来说，两类方法已被用于纯化来自不同组织的内皮细胞。阳性选择涉及偶联有EC特异性抗体或分子如血小板内皮细胞粘附分子(PCAM/CD31)、CD34、ve-钙黏着蛋白(CD144)、或荆豆凝集素-1(Ulexeuropaeusagglutinin-1，UEA陽1)的磁珠的应用(18-20);阴性耗减(negtivedepletion)使用抗非内皮细胞的特异性抗体排除细胞如成纤维细胞或单核细胞(21)。使用CD34Dynabeads被阳性选择的细胞或使用抗成纤维细胞和单核细胞抗体被阴性选择的细胞分别为约87。/。和71。/c)CD31阳性。然而，应用CD34珠的EC恢复只有约24。/。(19)。此外，通常使用粗制胶原酶分离EC，其显示实质的批次变化并且每次改变批次时需要确认(22)。本领域一直需要更快和更成功的内皮细胞恢复和接种，例如，用于体内应用。
发明内容本发明的第一个实施方式提供从脂肪组织制备内皮细胞的方法。洗涤得自吸脂术的脂肪组织并且从该组织收集细胞。用纯化的胶原酶制备物对细胞进行酶处理。该制备物被耗尽(depdeted)胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。在一个实施方式中，制备物包括纯化的中性蛋白酶(分散酶)。通过与包含第一抗体的磁珠接触来分选处理细胞，所述第一抗体对选自CD31、CD34、CD144和CD146的第一组的抗原或选自CD14、CD45和F19的第二组的抗原具有特异性。如果抗体对于第一组中的抗原具有特异性，则收集结合到所述磁珠的细胞，如果抗体对于第二组中的抗原具有特异性，则收集未结合到所述磁珠的细胞。本发明的第二个实施方式是分析内皮细胞制备物对于接种在血管移植物中的适宜性的方法。内皮细胞制备物被接种在适合内皮细胞的培养基中3天或更短的时间。培养基处于具有包被了细胞外基质蛋白的表面的容器(vessel)中。确定制备物中粘附到表面的细胞的量。本发明的另一实施方式是分离自脂肪组织的内皮细胞群。该细胞群具有下述特征细胞群中大于80%的细胞是存活的；细胞群中大于80%的细胞是内皮细胞；细胞群中大于50%的细胞在接种在基底(substrate)上的24小时内粘附到基底上。本发明的又一实施方式是包含接种到其内腔上的内皮细胞的人工血管移植物。内皮细胞以大于50,000个细胞/平方厘米的密度粘附到内腔。在阅读详细描述之后，本发明的这些实施方式和其它实施方式对于本领域普通技术人员将是显而易见的。图h用不同的酶孵育不同时间的细胞产量。图2:用不同的酶孵育不同时间的细胞存活。图3:消化后内皮细胞的百分率。图4:应用FACS分析，表征CD31纯化的内皮细胞。图5:纯化的内皮细胞在培养中显示鹅卵石形态。图6A:纯化的内皮细胞在培养中为vWF染色阳性。图6B显示细胞的核染色。图7:(图7A)未处理的工程化血管移植物的表面，平滑的胶原表面，没有内皮细胞存在。(图7B)在16小时内粘附到纤连蛋白包被的工程化血管移植物的CD31微珠纯化的EC。移植物是从组织工程化动脉的去细胞化(decellularization)产生的。这些纯化的EC细胞非常迅速地粘附到纤连蛋白包被的工程化血管移植物上。在约16小时内，约50M的表面区域已覆盖有纯化的EC。此实例中的大致细胞密度为110,000个细胞/平方厘米。图8:来自脂肪的脂肪衍生内皮细胞，其在工程化血管移植物上被接种16小时。细胞接种明显密集。此外，移植物表面上的细胞伸展由箭头标出，其为牢固粘附的指示。图9A-9D:CD31+细胞在第4天在DMEM/10%FBS/MVGS中培养。这些细胞分离自A:LB1、B:LB2、C:LB3、D:粗制I型胶原酶消化；图9A:LB1、图9B:粗制I型胶原酶、图9C:LB2、图9D:LB3。具体实施例方式我们描述了应用纯化的i型胶原酶和n型胶原酶，结合纯化的中性蛋白酶，以使酶变异和细胞损伤在分离期间减到最少的细胞分离方法。这种纯化的酶配制物有助于通过此方法分离的细胞的高存活和高铺板效率。我们使用CD31微珠富集脂肪来源的EC细胞。可以获得如84。/。高的CD144阳性EC。我们发现，CD31选择后的EC纯度与选择前的EC百分比有关。纯化的EC表达EC特异性标记物，如CD31、CD34、CD144和CD146,并且它们对CD105、CD133、CD117和CD141的表达呈阴性或表达弱。这些来自脂肪的纯化的EC群体显示出非常高的存活和快速的粘附速率。与己经报道的其它方法——其或是产生低的纯度或是低的存活/铺板效率——相反，存活和铺板这两种特性与高纯度相结合使这种分离方法真正可应用到临床。分离自脂肪的EC细胞可以不具有与分离自脉管系统的EC—样的全部相同特征。[22]内皮细胞以微血管内皮和大血管内皮的形式存在于身体所有组织中。为了从各种组织分离细胞，典型的是崩解组织，并且随后从也存在于该组织内的其它细胞中选择内皮细胞。本发明涉及从组织获得内皮细胞的方法，其涉及崩解步骤、内皮细胞选择步骤。在本发明的一些实施方式中，在崩解之前或崩解之后可以利用离心或其它的分离步骤以帮助获得内皮细胞。为崩解组织，可以采用几种技术。在一个实施方式中，可以使用机械搅拌和/或物理切碎以打碎组织结构。扭压组织或促使其通过滤网也可以崩解大的组织。也可以使用剧烈搅拌。可选地(或此外)，可以使用蛋白酶如细菌胶原酶、弹性蛋白酶、或中性蛋白酶破碎包含组织细胞的细胞外基质。可以使用纯化的胶原酶，尤其是耗尽了胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或嗜热菌蛋白酶的那些酶。可以使用离子螯合剂如EDTA，其结合介导细胞与基质粘附的二价阳离子，从而将细胞从其周围蛋白质中释放出来。所有这些技术可以在室温或高于室温的温度如37i:下进行，这可以使各种蛋白酶的活性最大化。可以改变孵育溶液的pH以增加组织的崩解，典型的pH值的范围为4.0-10.0。这些处理的应用时间可以从1分钟至长如24小时变化，这取决于组织密度和细胞外基质的强度。在一些实施方式中，在崩解步骤后，可以利用离心步骤作为收集细胞的方法。离心可以发生在任何类型的标准缓冲液中，或可以发生在专门的离心梯度溶液如Ficoll梯度中。离心步骤对于其中周围组织具有与内皮细胞不同的物理密度的组织尤其有利。例如，可以通过离心来改进从脂肪组织或从骨髓——两者都包含高密度的脂肪细胞——的内皮分离。离心可以将低密度的脂肪细胞从较高密度的内皮细胞中分离。然而，一般地，单独的离心对于从组织中选择分离内皮是不够的。这是因为其它的细胞类型如成纤维细胞和周细胞可以具有与内皮细胞相似的密度。因此，即使使用离心，为获得高的内皮纯度如大于80%、85%、90%或95%，随后的纯化步骤通常是必要的。可以在任何适合细胞的缓冲液(一种或多种)中洗涤组织和细胞，所述缓冲液例如，包括磷酸盐缓冲液。也可以使用细胞培养基。可以将洗过的组织和/或细胞在沉淀或离心后轻轻倒出，以分离迁移到不同相中的细胞类型和细胞碎片。作为内皮细胞分离中的额外步骤，使用细胞选择。选择可以是"阳性的"，其中利用内皮细胞特性或标记物来选择细胞，或者选择可以是"阴性的"，其中可以利用组织或离心球内的其它细胞类型的特性将这些其它细胞类型从内皮细胞中排除或除去。与本发明相容的分选方法的类型包括磁珠分离(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)以及淘析。可被用于选择的内皮细胞特异性标记物的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)的表面受体、血管内皮钙黏着蛋白(VE-Cadherin)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM或CD-31)、CD34(CD62(L-选择素)的配体)、表面凝集素(其被UEA-I所结合)、冯威勒布兰特因子(vonWillebrandfactor)、P-选择素、E-选择素、血管内皮细胞粘附分子(VCAM-1)、CD144(钙黏着蛋白-5，VE-钙黏着蛋白)、CD146(MCAM、MUC18、S-endo)、和细胞间粘附分子(ICAM-1)。在这些中，对本发明最有利的那些可以包括在未活化内皮细胞的表面表达的那些，并且将包括CD-31、VE-钙黏着蛋白、VEGF受体以及凝集素。这些列举仅仅是示例性的并且不是限制性的。阴性选择性标记物的例子将是组织内其它细胞类型的那些表面标记物，并且将因此而有些组织特异性。许多CD标记物与本发明相容，尤其是识别组织中污染细胞类型如成纤维细胞的那些标记物。作为具体例子，成纤维细胞、周细胞和平滑肌细胞表达血小板衍生生长因子的表面受体(PDGF受体)，并且这种标记物可以被用于选择细胞，以便从内皮细胞群中排除或除去。可以作为阴性选择标记物被靶向的具体抗原包括CD14、CD45和F19。如果FACS或磁珠细胞分选被用于细胞选择，那么上述类型的阳性或阴性标记物中的一种或一些组合将被用于实现选择。一般地，细胞特异性标记物的特异性抗体或其它结合分子将被结合到荧光团以进行FACS，或者将被结合到磁珠以通过MACS进行细胞分离。可以利用阳性选择或阴性选择，或者，在一些实施方式中，可以利用阳性选择和阴性选择的组合。可选地，可以利用以几种标记物、阳性和/或阴ii性地进行选择。可选地，淘选可被用作选择方法；这种方法依赖于组织中的内皮细胞和其它细胞的具体尺寸和密度特征。内皮尺寸和密度的具体范围—其可以与组织中其它细胞类型的尺寸和密度仅仅略微不同——可以被用于从组织中保留的细胞类型中选择内皮细胞。此外，预见到一个特定的选择方法不排除使用额外的方法。也就是说，在本发明的范围内可以同时或顺序使用几种内皮细胞选择方法。也可以重复某些步骤以获得更好的纯化或产量。引人注目地，本发明的内皮细胞制备物高度并快速粘附到适当的基底上。因此，我们已观测到，与基底的粘附以高比率和高密度并且在短的时间段内发生。粘附可以被评价，例如，在接种后12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、和/或72小时。在如这些时间一样短的时间时，我们已经观测到显著的粘附率。可以在容器如载片或培养容器表面，或在血管移植物上评价粘附。快速粘附到基底("粘附性")和高存活以及内皮纯度包含在本发明的细胞群的标志性特征(signatureproperties)中。合适的基底典型地包被有细胞外基质蛋白质。这些蛋白质可以包括胶原蛋白、纤连蛋白和明胶。本发明的细胞群在接种后12小时、18小时、24小时、36小时、48小日寸、和/或72小时达到至少50%的粘附。根据本发明的内皮细胞群是高存活的。不被任何理论或机制所束缚，据认为，现有技术的崩解方法如此粗糙以致于存活和粘附性受到不利影响。本发明的细胞群的至少50%、60%、70%、80%、或甚至90%是存活的。根据本发明的内皮细胞群是高纯度的。采用评价内皮细胞同一性的现代标准，即采用如上所述的适当抗原标记物，本细胞群是至少约50%、60%、70%、80%、或甚至90%的内皮细胞。这种内皮细胞标记物包括CD31+、CD34+、CD144+、CD146+、CD133-、CD45-、CD117-、和/或CD14F。而且，内皮细胞可以通过它们在培养中分泌tPA和前列环素的能力来表征。所有这些标记物可能不在内皮细胞制备物中被同样地充分表达。此外，不意图被任何理论所束缚，假定现有技术的细胞群由于真实内皮细胞的比率禾n/或低存活而相对于它们意图的目的是不成功的。高内皮细胞纯度、高存活和高粘附的组合结果使待取自患者的吸脂样品能够接收血管移植物，快速处理所述样品以使所获得的细胞能被用于定位在血管移植物的内腔，并且在同一天或两天或三天内将所述血管移植物植入到同一患者内。而且，这些特征使内腔的内皮细胞以大于50,000个细胞/平方厘米、大于75,000个细胞/平方厘米、大于85,000个细胞/平方厘米、大于95,000个细胞/平方厘米、大于105,000个细胞/平方厘米、大于110,000个细胞/平方厘米的密度的群集。这样高的细胞密度将增加开放性并减少血管移植物的失败。实施例1皮下脂肪组织获自吸脂术或其它手术程序。切碎脂肪组织并且随后用细菌胶原酶作用以实现崩解。随后离心崩解的组织以便将脂肪细胞从其它细胞类型(包括内皮细胞)中分离，其它细胞存在于离心球(离心沉淀物，centriftigedpellet)中。重悬离心球，之后进行针对内皮特异性标记物的基于抗体的选择。采用针对内皮表面分子VE-钙黏着蛋白的荧光激活的细胞分选。在这些条件下，崩解后，在离心球中，每克脂肪组织产生一百万至一百二十万个细胞。针对VE-钙黏着蛋白的细胞分选导致内皮细胞选择。我们已经发现，在离心细胞球中的内皮细胞含量为约15-20%。这转变为每克脂肪中大约200,000个内皮细胞。内皮细胞的细胞存活一般为85-90%，如通过7AAD染色所评定的。因此，如果从指定的患者获得10克皮下脂肪(相应于2茶匙)，则获得大约二百万活的内皮细胞，该数量足以排列于血管移植物的内部，如可能被用于搭桥手术。分离的内皮细胞的纯度为大约90%，如通过重复荧光激活的细胞分选所评定的。实施例2我们检测了消化吸脂组织并释放内皮细胞(EC)的LiberaseBlendzymes(RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana)。LiberaseBlendzymes由纯化的胶原酶和其它蛋白酶组成，而且不同的批次具有相同的酶活性。因此，可以避免由酶批次而产生的变化。细胞产量(细胞数目/克脂肪)和细胞存活(采用7-AAD通过FACS测量)被显示在图1和图2中。具有相同孵育时间(30分钟)的LB1和LB3之间的平均细胞产量相似，为每克脂肪中大约5"05个细胞。应用LB3时，更长孵育时间(40分钟)几乎使细胞产量加倍(1><106)而具有相当的细胞存活。采用不同的LiberaseBlendzyme酶和消化时间，作为从脂肪组织释放的全部非脂肪细胞的一部分的EC的百分率是相似的，如所示(图3)。这些细胞在酶消化后没有通过任何方式纯化，而只是通过针对内皮特异性标记物进行FACS分选而进行表征。这些数据显示，在酶消化之后，非脂肪细胞群是混合的，具有与其它细胞类型混合的内皮细胞部分。不纯化这种由酶消化产生的混合细胞群，则该混合群对于接种到血管移植物上而言不是最佳的，因为污染的成纤维细胞和其它细胞类型会促进内膜增生和移植失败。应用利用CD31微珠的阳性选择纯化来源于酶消化后的混合细胞群。纯化的EC表达CD31、CD34、CD144和CD146;并且它们为CD105和CD141阴性(图4)。如通过对内皮高度特异的标记物——CD144(VE-钙黏着蛋白)表达所评定的，该群体的内皮纯度为80%以上。纯化的EC在培养中生长，显示出典型的EC鹅卵石形态(图5)，并且免疫细胞化学染色显示冯威勒布兰特因子(vWF)阳性(图6)。冯威勒布兰特因子(vWF)是高度分化内皮的标记物，说明用该技术分离的EC的高的功能性。纯化的EC细胞在约IO小时内粘附到纤连蛋白包被的、工程化的血管移植物上。移植物由组织工程化动脉的去细胞化产生。去细胞化的移植物内腔表面没有内皮，光滑并且是蛋白质的(图7A)。纯化的EC细胞非常快速地粘附到纤连蛋白包被的工程化血管移植物上。在大约16小时中，约50。/。的表面区域已经被纯化的EC所覆盖。本实施例中的近似细胞密度为110,000个细胞/平方厘米(图7B)。[39]已经检测了应用抗-CD31微珠的阳性选择的EC富集。表达EC特异性标记物CD144的细胞的百分数被用于测定EC的纯度。CD31富集后的EC纯度与富集之前EC的百分数直接相关(表l)。用本方法所观测到的最高EC纯度为大约87%。这反映了纯化前个体间关于EC百分数的显著不同。表1.富集后的EC纯度取决于富集前的EC%。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>从LB1消化释放的细胞在EBM-A培养基中培养IO小时后具有最高的铺板效率(表2，图9A-9D)。来自LB1消化的铺板效率为至少58%。这显著高于用LB2和LB3观察到的铺板效率。重要的是，铺板效率比应用其他人使用的粗制胶原酶的铺板效率更高。本发明的一个关键方面是来自脂肪组织的高部分的纯化EC的快速铺板(在这种情况下，在10小时或更短的时间内)。使用LB1释放并随后纯化的细胞具有这样高的铺板效率的潜在原因可能是中性蛋白酶(在LB1中)是比嗜热菌蛋白酶(在LB3中)更温和的酶，并且用LB1消化的细胞可能因此保留细胞粘附所需的受体。此外，非纯化的胶原酶也可能损伤细胞，并且导致比高度纯化形式的酶低的铺板效率。表2.在EBM-A中培养10小时后的铺板效率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>'EC恢复(％)=(起始细胞数目x纯化前的EC%)/(CD31阳性收集物x纯化后的EC。/。)xl00实施例3-材料与方法1.材料l丄组织脂肪组织样品从吸脂抽吸(liposuctionaspirates)或切开的皮下脂肪组织获得。1.2.试剂1.2丄无钙镁的磷酸盐缓冲液(PBSlx)或无钙镁的Hanks'平衡盐缓冲液(HBSSlx)(Gibco)1.2.2.M199培养基(Gibco)1.2.3.EBM-2培养基(Clonetics)1.2.4.)RPMI(Gibco)1.2.5.牛血清白蛋白(BSA)(MiltenyiBiotech)1.2.6.LiberaseBlendzyme1禾口LiberateBlendzyme3(Roche)1.2.7.I型胶原酶(Sigma)1.2.8.L-谷氨酰胺(Invitrogen)1.2.9.氢化可的松(Sigma)1.2.10.联丁酰基环AMP(Sigma)1.2.11.青霉素-链霉素溶液(lOO，Signal)1.2.13.胰蛋白酶-EDTA(0.25毫克/毫升)(Invitrogen)1.2.14.乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(Sigma)1.2.15.胎牛血清(FBS)，认证的，热失活的(US)(Gibco)1.2.16.CD31微珠(MiltenyiBiotech)1.2.17.FcR封闭剂(blockingreagent)(MiltenyiBiotech)1.2.18.CD31-Fitc(BD)1.2.19.CD45-APC(BD)1.2.20.CD105Fitc(Chemicon)1.2.21.CD117APC(BD)1.2.22.CD133PE(BD)1.2.23.凝血调节蛋白(CD141-PE,BD)1.2.24.Ve-转黏着蛋白-PE(CD144-PE,eBiosciences)1.2.25.CD146-PE(BD)1.2.26.Uea-l-fitc(Biomeda)1.2.27.7-AAD(BD)1.2.28.vWF(冯威勒布兰特因子)抗体(Dako)1.2.29.4。/。多聚甲醛(USB)1.2.30.曲拉通(Triton)X-100(Sigma)1.2.31.吐温-20(Sigma)1.2.32.4，,6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸化物(DAPI)(MolecularProbes)1.3.供应品1.3.1.500ml塑料离心瓶(Corning)1.3.2.0.2(im滤器单元(Nalgene)1.3.3.50ml圆锥形管(Coming)1.3.4.15圆锥形管(Coming)1.3.5.5ml聚苯乙烯管(BD)1.4设备1.4.1.AutoMACSSeparator是台式自动化的磁性细胞分选器(MiltenyiBiotech)1.4.2.BDFACSCalibur系统(BD)1.4.3.滴定板振动器(TiterPlateShaker)(Lab-LineInstruments)1.4.3.离心机(Beckman)1.4.4.生物安全超净台(BiosafetyHood)1.4.5.C02培养箱(NUAIR)1.4.6.倒置显微镜——带有Epi-荧光附件(荥灯照明器型号名称(MercuryLampIlluminatormodelname):C-SHG)(NikonInstrumentsIncorporation,Melville,NY)并且配备有照相机光度冷拍(cameraphotometriccool-snap)(Nikon)的NikonEclipseTSIOO。1.5.培养基储存液所有的培养基溶液通过0.2过滤器单元过滤并且在50毫升管中于-2(TC冷冻。1.5.1.EBM-A培养基EBM-2基础培养基(CLOTECH)20%FBSL-谷氨酰胺(0.292毫克/毫升)氢化可的松(1微克/毫升)19DicAMP(0.25毫克/毫升)1%青霉素-链霉素抗生素溶液1.5.2.基于DMEM的培养基DMEM(Invitrogen)腦FBS1xMVGS(CascadeBiologies)青霉素-链霉素2.方法在运送到实验室之后，立即处理吸脂样品以分离MVEC。如果不能立即处理样品，将其保存在室温下并且在24小时内处理。进行实验之前，将水浴升温至37'C。下列所有的操作在生物安全超净台中进行。2丄分离2丄1.升温500或更多的具有0.1。/。葡萄糖的PBS或HBSS缓冲液。用一次性工作台(bench)保护器覆盖生物安全超净台的表面。2丄2.制备消化溶液(0.75单位/毫升LiberaseBlendzymel(LBl)或LiberaseBlendzyme3(LB3)或4毫克/毫升I型胶原酶，在含有4毫克/毫升BSA和0.1%葡萄糖的PBS或HBSS中)并使其在37。C水浴中保温。2丄3.将M199和EC培养基在37。C水浴中保温。2.1.4.制备RPMI/1%FBS/2mMEDTA并保持在4°C。2丄5.为了保持最佳的无菌条件，在生物安全工作台下打开用于吸脂程序的手术容器。将200毫升脂肪组织分散在500毫升离心瓶(Coming)中。加入等体积的温热PBS或HBSS。搅拌洗涤组织，然后进行相分离3-5分钟。吸出下漂浮(infranatant)溶液(较低的液相)。重复洗漆几次直到获得清澈的下漂浮溶液(通常3-4次)。2丄6.最后一次洗涤后以1500-2000转/分钟将细胞离心5-15分钟。吸出下漂浮溶液。测量脂肪组织并且每1克脂肪加入大约1毫升温的LB1或LB3、或I型胶原酶溶液。盖紧盖子并将它们放置在37"C培养箱中的振荡器上，轻轻振荡30-40分钟。每10分钟手动混和组织。2丄7.加入150毫升温的M199培养基并且以1200转每分钟离心细胞5分钟。2丄8.旋转之后，EC以及其它细胞将在瓶或管的底部形成球(团)(这通常将包括暗红色细胞层)。小心地除去油和脂肪的顶层、主要脂肪细胞(黄色的悬浮细胞层)和消化溶液的下层。留下小量的胶原酶溶液在球的上面，以使细胞不被弄乱。2丄9.将细胞悬浮在10毫升温的M199培养基中并且用70微米的细胞滤网过滤细胞。在室温下，在合适的离心机中以1200转/分钟将细胞离心5分钟。2丄10.吸出剩余的培养基。在吸出时，吸液管的尖端应该从顶部吸以尽可能彻底地除去油。细胞球应该在管的底部。2.1.11.在每一个管中，用10毫升的冷RPMI/1%FBS/2mMEDTA培养基重悬细胞。在一个50毫升圆锥形管中汇集细胞。通过70微米的滤网过滤细胞。2丄12.移出150微升细胞悬液并使用Sysmex计数细胞。2.2.用CD31微珠富集EC2.2丄将25xl0、50xl(^个细胞转移到15毫升的圆锥形管并以1200转/分钟在室温下离心5分钟。2.2.2.吸出上清并且悬浮细胞，至每60微升RPMI/1%FBS/2mMEDTA培养基1(^106个细胞的最大浓度。每1(^106个细胞加入20微升FcR封闭剂。简单混和，并且随后每10xl(^个细胞加入20微升CD31-微珠。在4'C孵育细胞15分钟。2.2.3.孵育后，用RPMI/1%FBS/2mMEDTA培养基漂洗细胞并且以300g离心细胞IO分钟。2.2.4.在2毫升RPMI/1%FBS/2mMEDTA培养基中悬浮细胞球。2.2.5.将细胞加载在autoMACS上并且使用POSSELD程序分离。2.2.6.收集CD31阳性细胞和CD31阴性细胞。2.2.7.将150微升CD31阳性细胞或CD31阴性细胞转移到微量离心管并且应用Sysmex计数细胞。2.2.8.应用荧光激活的细胞分选(FACS)在CD31分离之前和之后表征细胞。通过用7-AAD对细胞染色，使用FACS测定存活。2.3铺板效率2.3丄以2-5xl0V平方厘米的密度，将CD31纯化的EC接种在ECM如纤连蛋白、明胶、胶原蛋白I包被的，含有EC培养基如EBM-A或MEM/10%FBS/MVGS的培养板中并在5%C02、37°C的培养箱中培养。2.3.2.第二天，轻微摇动平板并且将含有未粘附的细胞的培养基收集在管中。用PBS漂洗细胞并且将细胞收集在同一个管中。向培养板加入新鲜培养基并放回到培养箱中。2.3.3.以1500转/分钟离心收集的培养基5分钟。2.3.4.吸取培养基并且将细胞悬浮在200到500微升的PBS中。剧烈吸吹细胞并且使用Sysmem计数细胞。2.3.5.铺板效率=(全部接种细胞的数目-漂浮细胞的数目)/全部接种细胞)。4.细胞表征收集CD31微珠分离之前和之后以及培养48小时的细胞并且通过FACS分析CD31、CD34、CD45、CD141和CD144、CD146的表达而进行表征。用4%多聚甲醛固定来自96孔板的一些细胞并且对vWF、eNOS或CD31染色。2.5.在人工移植物上接种EC在37。C，在6孔板中用人粘连蛋白(100微克慮升)对0.5x0.5厘米的HumacyteTM工程化移植物片包被^小时。然后将CD31微珠选择的EC(lxl0、5xl0"加入到孔中并在培养箱中孵育10-16小时。所述移植物在福尔马林中固定并且用扫描电子显微镜(SEM)对这些移植物进行扫描。参考文献1.AmericanHeartAssociation-HeartDiseaseandStrokeStatistics.2006Update.http:〃www.americanheart.Org/downloadable/heart/1166711577754HS—StatsInsideText.pdf2.PomposelliFBJr,AroraS,GibbonsGW,FrykbergR，SmakowskiP,CampbellDR,FreemanDV3LoGerfoFW.Lowerextremityarterialreconstructionintheveryelderly:successfuloutcomepreservesnotonlythelimbbutalsoresidentialstatusandambulatoryfunction.JVaseSurg.1998;28(2):215-25.3.VeithFJ,MossCM，SprayregenS，MontefUscoC.Preoperativesaphenousvenographyinarterialreconstructivesurgeryofthelowerextremity.Surgery.1979;85(3):253-6.4.VeithFJ,GuptaSK，AscerE，White-FloresS,SamsonRH，ScherLA,TowneJB,BernhardVM，BonierP，FlinnWR,etal.Six-yearprospectivemulticenterrandomizedcomparisonofautologoussaphenousveinandexpandedpolytetmfluoroethylenegraftsininfrainguinalarterialreconstructions.JVaseSurg.1986;3(1):104-14.5.TiwariA,SalacinskiHJ,HamiltonG,SeifalianAM.Tissueengineeringofvascularbypassgrafts:roleofendothelialcellextraction.EurJVaseEndovascSurg.2001;21(3):193-201.Review.6.ZillaP,FasolR,DudeckU,SiedlerS,PreissP，FischleinT,Muller-GlauserW,BaitellaG,SananD,OdellJ，etal.Insitucannulation，microgridfollow-upandlow-densityplatingprovidefirstpassageendothelialcellmassculturesforinvitrolining.JVaseSurg.1990;12(2):180-9.7.JarrellBE,WilliamsSK，StokesG，HubbardFA,CarabasiRA，KoolpeE,GreenerD，PrattK，MoritzMJ,RadomskiJ，etal.Useoffreshlyisolatedcapillaryendothelialcellsfortheimmediateestablishmentofamonolayeronavasculargraftatsurgery.Surgery.1986;100(2):392画9.8.WilliamsSK,JarrellBE，RoseDG,PontellJ,KapelanBA，ParkPK，CarterTL.Humanmicrovesselendothelialcellisolationandvasculargraftsoddingintheoperatingroom.AnnVaseSurg.1989Apr;3(2):146-52.9.PasicM,Muller-GlauserW,vonSegesserL,OdermattB,LachatM,TurinaM.Endothelialcellseedingimprovespatencyofsyntheticvasculargrafts:manualversusautomatizedmethod.EurJCardiothoracSurg.1996;10(5):372-9.10.WilliamsSK,RoseDG,JarrellBE.MicrovascularendothelialcellsoddingofePTFEvasculargrafts:improvedpatencyandstabilityofthecellularlining.JBiomedMaterRes.1994Feb;28(2):203隱12.11.WilliamsSK,JarrellBE，KleinertLB.Endothelialcelltransplantationontopolymericarteriovenousgraftsevaluatedusingacaninemodel.JInvestSurg,1994Nov-Dec;7(6):503画17.12.ParkPK,JarrellBE,WilliamsSK，CarterTL,RoseDG，Martinez-HernandezA,CarabasiRA3rd.Thrombus-free,humanendothelialsurfaceinthemidregionotaDacronvasculargrattintnesplanchnicvenouscircuit—observationsafterninemonthsofimplantation.JVaseSurg.1990;11(3):468誦75.13.MeerbaumSO.SharpWV,SchmidtSP.Lowerextremityrevascularizationwithpolytetrafluoroethylenegraftsseededwithmicrovscularendothelialcells.In:Zilla，P,Fasol，R.Callow,A.editors.AppliedCardiovascularBiology1990-91.InternationalSocietyForAppliedCardiovascularBiology.2nded.Basel:Karger,1992,ppl07-119etal.2414.SharpWV,SchmidtSP,MeerbaumSO,PippertTR.DerivationofhumanmicrovascularendothelialceIsforprostheticvasculargraftseeding.AnnVaseSurg.1989;3(2):104-7,15.SterpettiAV,HunterWJ,SchultzRD，SugimotoJT3BlairEA,HackerK，ChasanP，ValentineJ.Seedingwithendothelialcellsderivedfromthemicrovesselsoftheomentumandfromthejugularvein:acomparativestudy.JVaseSurg.1988;7(5):677-84.16.ArtsCH，HedemanJoostenPP,BlankensteijnJD，StaalFJ，NgPY,Heijnen-SnyderGJ,SixmaJJ,VerhagenHJ，deGrootPG，EikelboomBC.Contaminantsfromthetransplantcontributetointimalhyperplasiaassociatedwithmicrovascularendothelialcellseeding.EurJVaseEndovascSurg.2002;23(l):29-38.17.ArtsCH,BlankensteijnJD,Heijnen-SnyderGJ，VerhagenHJ，HedemanJoostenPP，SixmaJJ,EikelboomBC3deGrootPG.Reductionofnon-endothelialcellcontaminationofmicrovascularendothelialcellseededgraftsdecreasesthrombogenicityandintimalhyperplasia.EurJVaseEndovascSurg.2002;23(5):404-12.18.HewettPW，MurrayJC.ImmunomagneticpurificationofhumanmicrovesselendothelialcellsusingDynabeadscoatedwithmonoclonalantibodiestoPECAM-I.EurJCellBiol.1993;62(2):451-4.19.ArtsCH,deGrootP，Heijnen-SnyderGJ，BlankensteijnJD，EikelboomBC，Slaper-CortenbachIC.ApplicationofaclinicalgradeCD34-mediatedmethodfortheenrichmentofmicrovascularendothelialcellsfromfattissue.Cytotherapy.2004;6(l):30-42.20.MiebachS,GrauS,HummelV，RieckmannP3TonnJC,GoldbrunnerRH.IsolationandcultureofmicrovascularendothelialcellsfromgliomasofdifferentWHOgrades.JNeurooncol.2006;76(l):39-48.21.ArtsCH，Heijnen-SnyderGJ，JoostenPP，VerhagenHJ,EikelboomBC:SixmaJJ,deGrootPG.Anovelmethodforisolatingpuremicrovascularendothelialcellsfromsubcutaneousfattissueidealfordirectcellseeding.LabInvest.2001;81(10):1461-5.22.WilliamsSK3McKenneyS3JarrellBE.Collagenaselotselectionandpurificationforadiposetissuedigestion.CellTransplant.1995;4(3):281-9.权利要求1.从脂肪组织制备内皮细胞的方法，其包括洗涤从吸脂术患者获得的脂肪组织；收集来自所述洗涤的脂肪组织的细胞；用纯化的胶原酶制备物酶处理所述细胞，其中所述制备物被耗尽胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶；通过与包含第一抗体的磁珠接触来分选所述处理细胞，所述第一抗体对选自CD31、CD34、CD144和CD146的第一组的抗原或选自CD14、CD45和F19的第二组的抗原具有特异性；如果所述抗体对于所述第一组中的抗原具有特异性，则收集结合到所述磁珠的细胞，如果所述抗体对于所述第二组具有特异性，则收集未结合到所述磁珠的细胞。2.:权利要求l所述的方法，其中所述收集的细胞在吸脂术的3天内被接种到血管移植物上。3.权利要求l所述的方法，其中所述收集的细胞在吸脂术的2天内被接种到血管移植物上。4.权利要求1所述的方法，其中所述收集的细胞在吸脂术的1天内被接种到血管移植物上。5.权利要求1所述的方法，其中所述血管移植物被植入到所述吸脂术患者体内。6.权利要求1所述的方法，其中包含一种以上抗体的磁珠与所述处理细胞接触。7.权利要求1所述的方法，其中所述纯化的胶原酶制备物包含中性蛋白酶。8.权利要求1所述的方法，其中所述胶原酶来自溶组织梭菌(C7oiWww/h'加/Wc讀)。9.权利要求7所述的方法，其中所述中性蛋白酶来自多粘芽孢杆菌(5acz7/ws/o/戸f:ca)。10.分析内皮细胞制备物对于接种在血管移植物中的适宜性的方法，其包括在适合内皮细胞的培养基中培养内皮细胞制备物3天或更短的时间，其中所述培养基在具有包被了细胞外基质蛋白的表面的容器中；测定所述制备物中粘附到所述表面的细胞的数量。11.权利要求10所述的方法，其中所述内皮细胞制备物被培养2天或更短的时间。12.权利要求10所述的方法，其中所述内皮细胞制备物被培养1天或更短的时间。13.分离自脂肪组织的内皮细胞群，所述细胞群具有下列特征所述细胞群中大于80%的细胞是存活的；所述细胞群中大于80%的细胞是内皮细胞；所述细胞群中大于50%的细胞在接种在基底上的24小时内粘附到所述基底上。14.权利要求13所述的细胞群，其中所述细胞群中大于50%的细胞在接种到所述基底上的12小时内粘附到所述基底上。15.权利要求13所述的细胞群，其中所述内皮细胞是CD31+。16.权利要求13所述的细胞群，其中所述内皮细胞是CD31+、CD34+、CD144+、CD146+、CD133—、CD117-、禾HCD14F。17.权利要求13所述的细胞群，其中所述内皮细胞得自吸脂样品。18.权利要求13所述的细胞群，其中所述内皮细胞在培养中分泌tPA和前列环素。19.包括接种到其内腔上的内皮细胞的人工血管移植物，其中所述内皮细胞以大于50,000个细胞/平方厘米的密度粘附到所述内腔。20.权利要求19所述的移植物，其中所述细胞以大于75,000个细胞/平方厘米的密度粘附。21.权利要求19所述的移植物，其中所述细胞以大于85,000个细胞/平方厘米的密度粘附。22.权利要求19所述的移植物，其中所述细胞以大于95,000个细胞/平方厘米的密度粘附。23.权利要求19所述的移植物，其中所述细胞以大于105,000个细胞/平方厘米的密度粘附。24.权利要求19所述的移植物，其中所述细胞以大于110,000个细胞/平方厘米的密度粘附。全文摘要已证明脂肪组织作为适合组织工程的内皮细胞或血管内皮细胞的丰富、易得并且充足的来源。我们描述了使用纯化酶和基于抗体的选择来分离和纯化内皮细胞的详细方法。所述细胞可以从吸脂术获得并被用在血管移植物中。文档编号C12N5/02GK101437937SQ200780013885公开日2009年5月20日申请日期2007年3月7日优先权日2006年3月7日发明者L·E·尼克拉松,Y·李申请人:哈玛赛特公司