从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法。该方法包括以下步骤：S1.取富含脂肪的组织，采用Trizol法获得总RNA溶液；S2.采用RNA纯化柱对总RNA溶液进行纯化，得到mRNA。采用本发明的技术方案提取的mRNA样品纯度高、完整性好，能很好地满足高通量测序转录组建库要求，并且，耗时短，成本低。
【专利说明】从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体而言，涉及一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法。
【背景技术】[0002]总RNA的提取是分子生物学的基本内容之一，高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。RT-PCR、Real-Time PCR、Northern、cDNA文库构建等分子生物学研究的开展首先必须获得纯度高、完整性好的总RNA。总RNA的质量如何是通过安捷伦2100芯片生物分析仪来判定的，该分析仪已被证明可替代费时费力的凝胶电泳技术，可以提供快速自动化的高品质数字化数据，用RNA完整数(RIN)来表示。对于动物组织来说，当RIN值达到7.0时才能满足后续建库要求。脂肪组织是一个重要的内分泌器官，它参与机体的多种生理生化代谢，动物脂肪组织的研究对脂肪组织生长发育、肉品质等具有重要意义。脂肪组织单位体积细胞数较少，且单位细胞内的总RNA含量也相对较少(Mersmann, Harry J.Seminars in Plastic Srugery, 2002，16 (2): 195 ~197),这增加了从脂肪组织中提取总RNA的难度。
[0003]目前，提取脂肪组织的方法有Trizol和一些试剂盒的方法，但是直接按照试剂盒说明书操作提取的总RNA效果并不理想。于是人们对试剂盒和Trizol方法进行了改进，改进之后能较好的提取总RNA (吴江维，杨公社，孙超.脂肪组织RNA提取方法的改进[J].生物技术通报，2005，5:75-77，81)。但在实验过程中发现，用上述改进的Trizol方法提取出的牛肠脂总RNA并不能满足后续的转录组建库要求。因此，亟需开发出一种提取牛肠脂mRNA的方法以满足后续的转录组建库要求。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法，以解决现有技术中从富含脂肪的组织中提取的mRNA不能满足转录组建库要求的技术问题。
[0005]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法。该方法包括以下步骤:S1，取富含脂肪的组织，采用Trizol法获得总RNA溶液；S2，采用RNA纯化柱对总RNA溶液进行纯化，得到mRNA。
[0006]进一步地，Trizol法为吴江维改进的Trizol法。
[0007]进一步地，富含脂肪的组织为牛肠脂。
[0008]进一步地，SI包括:对牛肠脂进行匀浆、裂解、离心去除油脂、氯仿抽提、异丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到总RNA溶液。
[0009]进一步地，SI包括:在液氮中将牛肠脂研磨成粉末，向牛肠脂中加入Trizol，并震荡混匀后静置；离心去除油脂，用氯仿对获得的上清液进行抽提后，用异丙醇进行沉淀，将得到的沉淀用75%乙醇进行洗涤后用水溶解，得到总RNA溶液。
[0010]进一步地，SI包括:S11，取液氮速冻的牛肠脂，在液氮中将牛肠脂研磨成粉末，取100~150mg牛肠脂放入装有1.5ml Trizol的第一离心管中，将牛肠脂与Trizol震荡混匀后，在室温下静置IOmin ;S12，将第一离心管在4°C，12000rpm,离心lOmin，离心后去除上层油脂，将下层液体转入第二离心管，离心5min，去除上层油脂，将下清液转入第三离心管中；S13，向第三离心管中加入300 μ I氯仿，在漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相；然后将第三离心管在4°C，12000rpm离心IOmin ;将上清液转入第四离心管，加入与上清液等体积的氯仿，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相，然后将第四离心管在4°C，12000rpm离心IOmin ;S14，取第四离心管中的上清液到第五离心管中，加入与第五离心管中的上清液等体积的异丙醇，混匀后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm离心15min ;去除上清液，得到沉淀；S15，用体积百分比为75%乙醇清洗步骤S14中得到的沉淀2次，离心2min，用枪头吸取乙醇，置于室温干燥5~lOmin，用100 μ I DEPC处理过的水彻底溶解沉淀，得到总RNA溶液。
[0011]进一步地，75%乙醇是由7.5体积份无水乙醇和2.5体积份DEPC处理过的ddH20配制而成。
[0012]进一步地，DEPC处理过的CldH2O为将0.1体积份DEPC加入99.9体积份ddH20中涡旋混匀过夜(此处过夜为生物学中通常所说的过夜，一般是12~16小时)再经高温高压灭菌得到的水。
[0013]进一步地，S2为采用天根RNA纯化试剂盒对总RNA溶液进行纯化。
[0014]进一步地，S2包括:向总RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，混匀；加入250 μ I无水乙醇，混匀，将所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12，OOOrpm离心30秒，弃掉收集管中的废液；向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室温放置2min后，12，OOOrpm,离心30秒，弃废液，将CR2放入收集管中，重复漂洗一次，12，OOOrpm离心5min，去除残余液体，将吸附柱CR2转入第六离心管中，加入RNase-Free水,室温放置2min后，12, OOOrpm离心2min,再重复洗脱一次，获得纯化的`mRNA。
[0015]针对Trizol法提取富含脂肪组织的总RNA效果不能满足高通量测序转录组建库要求的问题，本发明中使用的吴江维改进的Trizol法初步提取富含脂肪组织中的总RNA，能快速从富含脂肪的组织中分离出总RNA，整个过程可在Ih内完成；并且因为含有RNase抑制剂可以保证总RNA产品的完整性；该方法提取的总RNA可大大的降低蛋白和DNA的污染。然后选用天根RNA纯化试剂盒对通过上述方法提取得到的总RNA进行继续纯化，该试剂盒是利用离心吸附柱技术，在高盐条件下mRNA与硅胶膜高效、专一地结合，可同时最大限度除去蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质，使得获得的mRNA样品纯度高、完整性好，能很好地满足高通量测序转录组建库要求，并且耗时短，成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0017]图1示出了用改进的Trizol方法提取得到的总RNA电泳结果，其中M代表Marker，为Trans2K Plus，样品牛肠脂原液上样1μ I ；
[0018]图2示出了用改进的Trizol方法提取得到的总RNA安捷伦2100检测结果；
[0019]图3示出了根据本发明实施例的方法提取得到的mRNA电泳结果，其中M代表Marker,为Trans2K Plus,样品牛肠脂原液上样I μ I。
[0020]图4示出了根据本发明实施例的方法提取得到的mRNA安捷伦2100检测结果。【具体实施方式】
[0021]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0022]针对Trizol法提取富含脂肪组织的mRNA效果不能满足高通量测序转录组建库要求的问题，本发明提供了一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法。
[0023]根据本发明一种典型的实施方式，提供一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法。该方法包括以下步骤:S1，取富含脂肪的组织，采用Trizol法获得总RNA溶液；S2，采用RNA纯化柱对总RNA溶液进行纯化，得到mRNA。应用该方法获得的mRNA样品纯度高、完整性好，能很好地满足高通量测序转录组建库要求，并且操作过程简单，成本低。
[0024]优选的,Trizol法为吴江维改进的Trizol法(吴江维，杨公社，孙超.脂肪组织RNA提取方法的改进[J],生物技术通报，2005，5:75-77，81)。
[0025]根据本发明一种典型的实施方式，富含脂肪的组织为牛肠脂。所述SI包括:对牛肠脂进行匀浆、裂解、离心去除油脂、氯仿抽提、异丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到总RNA溶液。优选的，在液氮中将牛肠脂研磨成粉末，向牛肠脂中加入Trizol，并震荡混匀后静置；离心去除油脂，用氯仿对获得的上清液进行抽提后，用异丙醇进行沉淀，将得到的沉淀用75%乙醇进行洗涤后用水溶解，得到总RNA溶液。
[0026]进一步优选的，SI包括:S11，取液氮速冻的牛肠脂，在液氮中将牛肠脂研磨成粉末,取100~150mg牛肠脂放入装有1.5ml Trizol的第一离心管中，将牛肠脂与Trizol震荡混匀后，在室温下静置10min ;S12，将第一离心管在4°C，12000rpm，离心lOmin，离心后去除上层油脂，将下层液体转入第二离心管，离心5min，去除上层油脂，将下清液转入第三离心管中；S13，向第三离心管中加入300 μ I氯仿，在漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相；然后将第三离心管在4°C，12000rpm离心10min ;将上清液转入第四离心管，加入与上清液等体积的氯仿，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相，然后将第四离心管在4°C，12000rpm离心IOmin ;S14，取第四离心管中的上清液到第五离心管中，加入与第五离心管中的上清液等体积的异丙醇，混匀后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm离心15min ;去除上清液，得到沉淀；S15，用体积百分比为75%乙醇清洗步骤S14中得到的沉淀2次,离心2min,用枪头吸取乙醇，置于室温干燥5~IOmin,用100 μ IDEPC (Diethypyrocar-bonate,焦碳酸二乙酯)处理过的水彻底溶解沉淀,得到总RNA溶液。
[0027]根据本发明一种典型的实施方式，S2为采用天根RNA纯化试剂盒对总RNA溶液进行纯化，当然并不限于天根RNA纯化试剂盒。当采用天根RNA纯化试剂盒对总RNA溶液进行纯化时，S2包括:向RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，混匀；加入250 μ I无水乙醇，混匀，将所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12，000rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液；向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室温放置2min后，12，000rpm,离心30秒，弃废液，将CR2放入收集管中，重复漂洗一次，12，000rpm离心5min，去除残余液体，将吸附柱CR2转入第六离心管中，加入RNase-Free水,室温放置2min后，12, 000rpm离心2min,再重复洗脱一次，获得纯化的mRNA。[0028]其中，用体积百分比为75%的乙醇是由7.5体积份无水乙醇和2.5体积份DEPC处理过的ddH20配制而成。DEPC处理过的ddH20为将0.1体积份DEPC加入99.9体积份ddH20中涡旋混匀过夜再经高温高压灭菌得到的水。
[0029]下面结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
[0030]实施例1
[0031]本实施例中所用的牛肠脂是新鲜、健康的材料。
[0032]实施过程如下:
[0033](I)取液氮速冻的牛肠脂样品500mg，用液氮迅速将其研磨成粉末，快速将约150mg样品转移至装有1.5ml Trizol的离心管中，上下剧烈震荡5min左右，待样品和溶液完全混勾后在室温下静直IOmin ；
[0034](2)4°C，12000rpm，离心lOmin，离心后上层含有大量油脂，用吸头除去，将下层液体转入一新管，然后再离心5min，去除上层油脂，将下清转入一新管中；
[0035](3)加入300μ I氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3_5min，使其自然分相；4°C, 12000rpm离心IOmin ;将上清转入一新管,加入等体积氯仿,镟润振荡器上振荡混匀，室温静置3-5min,使其自然分相,4?, 12000rpm离心IOmin ；
[0036]( 4 )取上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后置于-8(TC中放置20min,接着 4°C，12000rpm 离心 15min ；
[0037](5)用75% (v/v)乙醇清洗沉淀2次，再空离2min，用枪头吸取乙醇，置于室温干燥5-10min，用100 μ I DEPC处理过的水彻底溶解RNA沉淀；
[0038](6)向RNA溶液中加入350 μ I溶液RK，充分混匀。之后加入250 μ I无水乙醇，充分混匀，立即将所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12，OOOrpm离心30sec,弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500 μ I漂洗液RW，室温放置2min后，12，OOOrpm，离心30sec,弃废液，将CR2放入收集管中。重复漂洗一次，12，OOOrpm离心5min，去除残余液体，将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加适量RNase-Free /K，室温放置2min后，12，OOOrpm离心2min，之后再重复洗脱一次，获得纯化后的mRNA。
[0039]质量检测:经琼脂糖凝胶电泳检测，使用改良的Trizol方法和本发明的方法的结果见图1和图3，通过图1可以看出将经Trizol方法提取的总RNA电泳后，在该泳道出现了三条比较清晰的条带，没有一直拖带以及大片发光区域的存在，表明总RNA的完整性较好，图3上的经本发明提供的方法提取的mRNA的泳道上的电泳条带也是没有出现拖带以及一大片发光区域的存在，也表明mRNA完整性均很好。可见，使用改良的Trizol方法和本发明的方法所获得的RNA的完整性均良好。使用安捷伦2100精确检测mRNA完整性结果见图2和图4，图2的结果表明，使用改良的Trizol方法RIN值只有5.8，达不到高通量测序转录组建库要求(RIN值最低为7.0)，通过图4可见，使用本发明的方法RIN值达到8.0，该样品能很好地满足了高通量测序转录组建库要求。
[0040]其中，图2中的参数如表1中所示:
[0041]表1
【权利要求】
1.一种从富含脂肪的组织中提取mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: S1，取所述富含脂肪的组织，采用Trizol法获得总RNA溶液； S2，采用RNA纯化柱对所述总RNA溶液进行纯化，得到mRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Trizol法为吴江维改进的Trizol法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含脂肪的组织为牛肠脂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述SI包括:对所述牛肠脂进行匀浆、裂解、离心去除油脂、氯仿抽提、异丙醇沉淀、乙醇清洗和沉淀溶解，得到所述总RNA溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SI包括:在液氮中将所述牛肠脂研磨成粉末，向所述牛肠脂中加入Trizol，并震荡混匀后静置；离心去除油脂，用氯仿对获得的上清液进行抽提后，用异丙醇进行沉淀，将得到的沉淀用75%乙醇进行洗涤后用水溶解，得到所述总RNA溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SI包括: S11，取液氮速冻的所述牛肠脂，在液氮中将所述牛肠脂研磨成粉末，取100~150mg所述牛肠脂放入装有1.5ml Trizol的第一离心管中，将所述牛肠脂与所述Trizol震荡混匀后，在室温下静直IOmin ； S12，将所述第一离心管在4°C，12000rpm,离心lOmin，离心后去除上层油脂，将下层液体转入第二离心管，离心5min，去除上层油脂，将下清液转入第三离心管中； S13，向所述第三离心管中加入300 μ I氯仿，在漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相；然后将所述第三离心管在4°C，12000rpm离心IOmin ;将上清液转入第四离心管，加入与所述上清液等体积的氯仿，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3~5min，自然分相，然后将所述第四离心管在4°C，12000rpm离心IOmin ； S14，取所述第四离心管中的上清液到第五离心管中，加入与所述第五离心管中的上清液等体积的异丙醇，混匀后置于_80°C中放置20min，然后4°C，12000rpm离心15min ;去除上清液，得到沉淀； S15，用体积百分比为75%乙醇清洗所述步骤S14中得到的沉淀2次，离心2min，用枪头吸取乙醇，置于室温干燥5~lOmin，用100 μ I DEPC处理过的水彻底溶解沉淀，得到所述总RNA溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述75%乙醇是由7.5体积份无水乙醇和2.5体积份DEPC处理过的ddH20配制而成。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DEPC处理过的ddH20为将0.1体积份DEPC加入99.9体积份ddH20中涡旋混匀过夜再经高温高压灭菌得到的水。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2为采用天根RNA纯化试剂盒对所述总RNA溶液进行纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述S2包括: 向所述总RNA溶液中加入350 μ l溶液RK，混匀；加入250 μ I无水乙醇，混匀，将所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12，OOOrpm离心30秒，弃掉收集管中的废液；向吸附柱CR2中加入500 μl漂洗液RW，室温放置2min后，12，OOOrpm,离心30秒，弃废液，将CR2放入收集管中，重复漂洗一次，12，OOOrpm离心5min，去除残余液体，将吸附柱CR2转入第六离心管中，加入RNase-Free水，室温放置2min后，12，OOOrpm离心2min，再重复洗脱一次，获得纯化的mRNA。`
【文档编号】C12N15/10GK103820433SQ201410086548
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】丁雪, 王棪, 孔晓敏 申请人:北京诺禾致源生物信息科技有限公司