大鼠真皮间质干细胞的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，此方法是将皮肤组织先消化过夜，再将皮肤组织的真皮和表皮分开，再将真皮组织块贴于细胞培养皿中倒置37℃培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；真皮组织块培养至爬出细胞长满小皿即进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。本发明方法采用皮肤组织块贴壁法和酶消化法相结合的新方法，既能够有效地避免皮肤组织块贴壁法造成表皮角质细胞污染又可以避免酶消化法中长时间胰酶作用对细胞生长状态的影响。本发明为进一步深入研究皮肤组织中间质干细胞在皮肤发育、生长及损伤修复中的作用提供了可能。
【专利说明】大鼠真皮间质干细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞的体外培养领域，更具体的，本发明涉及一种大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]真皮间质干细胞(dermal fibroblasts)作为皮肤的组织细胞,具有十分重要的生物学功能，主要体现在以下几个方面:①作为皮肤真皮的基质细胞对维持细胞外基质的平衡和稳定具有重要作用通过分泌细胞因子影响表皮的发育及生长；③调控毛囊等皮肤附属结构生长和再生；④可以作为间质干细胞的重要来源，移植修复其他组织器官。体外培养的真皮间质干细胞对研究皮肤发育过程中真皮和表皮间的相互作用及皮肤损伤再生具有重要意义。
[0003]现有的真皮间质干细胞细胞培养方法主要有两种:组织块的直接贴壁法和Dispase (中性蛋白酶)与胰酶消化法。
[0004]组织块贴壁法主要是通过将皮肤组织剪成Imm3的组织块，然后将组织块贴于培养皿中应用低糖DMEM，10%FBS培养液进行培养一定时间(有成纤维状细胞爬出生长即可)，将生长的细胞进行消化，由于原代真皮胰酶消化时间比表皮角质细胞短，加入胰酶后先消化下来的细胞即为真皮间质干细胞，进行传代即可。此种方法是通过胰酶消化时间的不同区分真皮间质干细胞和角质细胞，分离培养得到的真皮间质干细胞混有表皮角质细胞，影响后续的实验研究。Dispase (中性蛋白酶)与胰酶消化法是将皮肤组织剪成细条状(宽度大约为:2mm，长约为:1cm)，将剪好的皮肤组织先用Dispase酶4°C消化过夜，将分离好的真皮组织剪碎后应用0.25%的胰酶消化30分钟，后将消化后的细胞800转每分钟离心5分钟，加入培养液种瓶传代。由于此种方法经过长时间的胰酶消化，使得到的真皮细胞的生长状态受到极大的影响，这样的细胞用于后续的实验研究得到的数据就会不稳定。
`[0005]由此可见，目前真皮间质干细胞的培养方法存在弊端，而真皮间质干细胞在皮肤组织的发育和组织修复再生中具有重要作用，因此获得表皮细胞污染少状态又好的真皮间质干细胞培养方法的确立是非常必要的。
【发明内容】
[0006]基于此本专利提供了一种新的大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法。
[0007]—种培养大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，包括取大鼠背部皮肤组织剪成细条状的步骤，然后将剪好的皮肤组织用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化过夜；用含有双抗的PBS洗涤一遍，再将皮肤组织的真皮和表皮分开，将真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次后剪成Imm3的组织块；真皮组织块贴于细胞培养皿中倒置37°C培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞长满小皿即可进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。
作为具体的实例，本发明包括以下步骤:[0008](I)将出生1-2天的大鼠乳鼠断颈处死，放入消毒酒精中浸泡5分钟，后在超净工作台中取出，无菌IOcm大皿中PBS洗涤三次；
[0009](2)将消毒酒精洗净的乳鼠背颈部的皮肤剪开，用眼科镊拽住头部和背部皮肤用力将皮肤组织撕下，将取好的背部皮肤放入含有青霉素和链霉素双抗的PBS中浸泡5分钟；
[0010](3)将取好的背部皮肤组织剪成细条状(宽度大约为:2mm，长约为:1cm)，将剪好的皮肤组织用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化过夜；
[0011](4)将0.25%的Dispase酶消化过夜的皮肤组织块用含有双抗的PBS洗涤一遍，用眼科镊分别夹住皮肤组织的真皮和表皮(表皮相对较薄并成毛玻璃样)将两者分开，将真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次后剪成Imm3的组织块；
[0012](5)，将此步骤(4)中获得的真皮组织块贴于细胞培养皿(3.5cm小皿)中倒置37°C培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；
[0013](6)真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞长满小皿即可进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。
[0014]在其中一个实例中，步骤(1)中应用乳鼠作为分离真皮间质干细胞的皮肤来源，利用乳鼠培养的原代的细胞状态和传代数量明显增加。
[0015]在其中一个实例中，步骤(3)中将皮肤组织剪成细条状(宽度大约为:2mm，长约为:1cm),并且Dispase酶的浓度为0.25%, 4°C冰箱中消化过夜效果最佳。
[0016]在其中一个实例中，步骤(3)中将皮肤组织应用Dispase酶消化以分离表皮和真皮，本发明采取了酶消化法和组织块培养法相结合新的真皮间质干细胞的培养方法，这种新方法经过Dispase酶的消化，将表皮分离掉能够有效的避免表皮角质细胞对真皮间质干细胞的污染。`
[0017]在其中一个实例中，步骤(5)中Dispase酶消化将分离表皮之后的真皮组织剪成Imm3的组织块再进行组织块的培养，本发明采取了酶消化法和组织块培养法相结合的真皮间质干细胞分离培养方法，这种方法把真皮组织剪成Imm3的组织块进行贴壁培养，避免了胰酶的长时间消化对原代细胞状态的影响。
[0018]在其中一个实例中，步骤(5)中真皮Imm3组织块倒置培养箱中贴壁应在30min左右，时间过短贴壁不牢固，贴壁时间过长组织块易干燥影响细胞爬出效率；
[0019]在其中一个实例中，步骤(6)中真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出即可对组织块中周围的细胞进行消化，此段时间角质细胞等杂细胞生长的可能性很低，这样此种新方法在保证原代细胞培养数量的同时避免其他细胞的污染。
[0020]本发明在原有的大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法上做了重要改进，将直接的组织块培养法和双酶(Dispase酶和胰酶)消化法相结合，分别利用两种方法的优点，先用Dispase进行消化，将表皮组织进行剥离，能够有效的避免表皮角质细胞的污染，后将分离表皮的皮肤组织进行组织块贴壁培养就避免了胰酶长时间消化对细胞的损伤，使细胞的状态更佳。
[0021]本发明建立了一套分离、培养及鉴定大鼠真皮间质干的新方法，证实该方法获得了活性更高纯度更高的真皮间质干细胞，同时对本发明所得细胞的表面标记、成骨成脂分化能力的检测证实本发明所得细胞为间质干细胞，从而为进一步深入研究真皮间质干细胞增殖、分化及皮肤组织发育，损伤修复中病理生理情况下的功能变化提供了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本分离培养大鼠真皮间质干细胞的方法示意图。
[0023]图2为倒置相差显微镜观察真皮组织块中爬出成纤维状细胞(40倍)。
[0024]图3为倒置相差显微镜观察本发明分离培养的细胞和酶消化法得到的细胞状态的比较(40倍)；其中A-本发明获得真皮间质干细胞，B-酶消化法获得真皮间质干细胞。
[0025]图4为RT-PCR检测本发明分离培养细胞及直接组织块培养法获得细胞中表皮标记CK19的表达情况。其中1-本发明获得细胞；2_直接组织块贴壁法获得细胞。
[0026]图5为流失细胞仪对本发明分离培养真皮间质干细胞细胞干性表面标记的检测(CD29，CD44, CD90 及 CD45)。
[0027]图6为成骨诱导检测发明分离培养真皮间质干细胞细胞的成骨能力(100倍)。
[0028]图7为成脂诱导检测发明分离培养真皮间质干细胞细胞的成脂能力(400倍)。 具体实施实例
[0029]以下实例所使用的主要材料和来源分别如下:
[0030]SD大鼠的I天龄乳鼠(江苏大学动物实验中心，此实验由江苏大学伦理委员会批准)；
[0031]0.25%膜蛋白酶(Amresco) ；0.25%Dispase中性蛋白酶(Gibco)；自配憐酸缓冲液PBS ;低糖 DMEM (Gibco); 胎牛血清 FBS (Gibco)；
[0032]细胞培养皿(3.5cm小皿)(corning);细胞培养瓶(corning);
[0033]CD44，CD29，CD90，CD45 及 IgG-FITC 对照的流失抗体；
[0034]间质干细胞成脂诱导液(cyagen);间质干细胞成骨诱导液(自行配置)；
[0035]以下结合附图和实例详细说明本发明。
[0036]实施例1，结合技术路线图1，对本发明具体实施步骤描述如下:
[0037](I)于江苏大学实验动物中心购买于当天出生SD大鼠乳鼠6只进行断颈处死，放入消毒酒精中浸泡5分钟，后在超净工作台中取出，放入无菌IOcm大皿中PBS洗涤三次；
[0038](2)将消毒酒精浸泡并经PBS洗净的乳鼠背颈部的皮肤剪开，用眼科镊拽住头部和背部皮肤稍用力将背部皮肤组织撕下，将取好的背部皮肤放入含有青霉素和链霉素双抗的PBS中浸泡5分钟；
[0039](3)将取好的背部皮肤组织的皮下脂肪和血管等皮下组织剔除干净(皮下组织剔除干净的皮肤组织无明显的红色血管)，后将皮肤组织剪成细条状(宽度大约为:2_，长约为:1cm)，将剪好的皮肤组织浸入0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化过夜；同时也将皮下组织剔除干净的皮肤组织剪成Imm3的组织块，贴于细胞培养皿(3.5cm小皿)中作为皮肤组织块贴壁法的对照；
[0040](4)将0.25%的Dispase酶消化过夜的皮肤组织块用含有双抗的PBS洗涤一遍，用眼科镊分别夹住皮肤组织的真皮和表皮(表皮相对较薄并成毛玻璃样)将两者分开，把分离表皮的真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次；
[0041](5)把分离得到的真皮 组织剪成Imm3的组织块，然后将此组织块贴于细胞培养皿(3.5cm小皿)中倒置37°C培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；与此同时应用0.25%的胰酶对真皮组织消化30min，收集细胞800转每分钟离心5分钟，将离心后得到细胞种瓶作为酶消化法的对照；
[0042](6)真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞生长到一定密度后即可进行胰酶消化传代培养做下一步的鉴定(图2)。
[0043]实施例2，将本发明所得真皮间质干细胞与对照方法(直接皮肤组织块贴壁法和酶消化法)所得细胞进行比较:
[0044]应用倒置显微镜对本发明方法与酶消化法所得P2代真皮间质干细胞的生长状态进行观察比较，结果显示本发明方法所得细胞的生长状态明显优于酶消化法，能够有效地的避免长时间的酶消化对细胞造成的损伤(图3)；
[0045]应用RT-PCR技术对本发明方法与皮肤组织块直接贴壁法所得P2代真皮间质干细胞中表皮指标CK19的检测(内参基因为:β -actin),结果显示由于本发明方法是先用Dispase酶将表皮组织剥离，所以本发明所得真皮间质干细胞中表皮角质细胞的污染明显少于皮肤组织块直接贴壁法，有效地避免了皮肤组织块直接贴壁法角质细胞污染严重的弊立而(图4)；
[0046]CK19及β -actin的引物序列如下如表1，
[0047]表1
【权利要求】
1.一种大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，包括取大鼠背部皮肤组织剪成细条状的步骤，其特征在于将剪好的皮肤组织用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化过夜，用含有双抗的PBS洗涤一遍，再将皮肤组织的真皮和表皮分开，将真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次后剪成Imm3的组织块；真皮组织块贴于细胞培养皿中倒置37°C培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞长满小皿即可进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。
2.根据权利要求1所述的大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，其特征在于大鼠背部皮肤组织来源于乳鼠。
3.根据权利要求1所述的大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，其特征在于细条状为宽度2臟,长1 cm。
【文档编号】C12N5/077GK103881970SQ201410085659
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】张斌, 许文荣, 钱晖, 朱伟, 张徐, 王梅, 吴晓丹, 朱艳华, 史惠 申请人:江苏大学