专利名称：可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细 胞工程技术领域，具体涉及一种可回复性永生化细胞，还涉及该可回复性永生化细胞的制备方法和应用。
背景技术：
骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是存在于骨髓、外周血和脐血等组织中的一类具有自我更新及跨胚层分化潜能的干细胞，具有易于体外分离、培养和扩增，容易导入外源基因，能在特定组织定居或归巢、低免疫原性和多向分化潜能等特点。 在特定的体外诱导环境下MSCs可分化为神经样细胞，动物实验也显示MSCs移植可在中枢神经系统内存活并能分化为有功能的神经样细胞，为神经系统疾病的治疗带来了新的希望。虽然MSCs在体内有着强大的增殖潜能，能多次分裂增殖，但在体外分离培养过程中，由于失去了神经体液的调节和细胞间的相互作用，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，细胞生存时间短，增殖能力有限且易发生变性。因此，获得体外增殖良好并具有正常性状的MSCs是MSCs体内外研究及临床应用的重要保障。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可回复性永生化大鼠MSCs，能在体外长期传代培养，增殖能力强且性状不发生改变，还可以容易地回复到永生化前的状态，生物安全性好，可以克服原代大鼠MSCs体外生存时间短、增殖能力有限且易发生变性的缺点。为达到上述目的，本发明提供的可回复性永生化大鼠MSCs，携带有SV40T (即猿病毒40大T抗原)基因及潮霉素抗性基因，所述SV40T基因的两端还有同向的Loxp位点。将SV40T基因导入大鼠MSCs，可调节细胞周期中的重要调控点，使细胞进入永生化的增殖状态，成为能在体外长期传代培养的永生化细胞系。在SV40T基因的两端各加上 1个Loxp位点并使2个Loxp位点的方向相同，利用Cre-LoxP重组酶系统的特性(如果2 个LoxP位点位于1条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效切除2个LoxP位点间的序列)，则SV40T基因能被Cre重组酶定向敲除，从而可使永生化的细胞回复到永生化前的状态。本发明的目的之二在于提供所述可回复性永生化大鼠MSCs的制备方法，操作简便、快速。为达到上述目的，本发明提供的可回复性永生化大鼠MSCs的制备方法，包括以下步骤
a.将逆转录病毒表达质粒SSR69与包装质粒pAmhpo共转染HEK293细胞，获得重组逆转录病毒；
b.将步骤a所得重组逆转录病毒感染大鼠MSCs，用潮霉素进行筛选，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。逆转录病毒表达质粒SSR69中含有SV40T基因及潮霉素抗性基因，所述SV40T基因的两端有同向的Loxp位点。将步骤a所得重组逆转录病毒感染大鼠MSCs，用潮霉素筛选阳性克隆，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。优选的，所述步骤b是将步骤 a所得重组逆转录病毒感染第3代大鼠MSCs，感染后第3天用浓度为4Pg/ml的潮霉素筛选 2周，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。
本发明的目的之三在于提供所述可回复性永生化大鼠MSCs的应用。体内外实验结果显示，本发明的可回复性永生化大鼠MSCs在体外能向神经元样细胞分化，移植入体内能改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)，因此，本发明的可回复性永生化大鼠MSCs可作为成神经诱导分化的种子细胞以及治疗新生大鼠HIBD的种子细胞应用。本发明的有益效果在于本发明通过将LoxP位点特异修饰的SV40T基因导入大鼠 MSCs,构建了可回复性永生化细胞株，该细胞株具有与原代大鼠MSCs同样的生物学特性， 还具有体外增殖能力强，生物学性状稳定，可回复到原有状态，生物安全性好等特点，能代替原代大鼠MSCs进行体外神经分化及体内移植治疗神经系统疾病的实验研究，因此，本发明为上述研究提供了重要的细胞工具。
图1是第3代大鼠MSCs光镜图(A，100X)和H. E染色图(B，100X)。图2是第3代大鼠MSCs表面标志⑶34、⑶45、⑶90及⑶106的流式细胞检测图。图3是可回复性永生化大鼠MSCs潮霉素筛选图。图4是第10代可回复性永生化大鼠MSCs光镜图(A，100 X)和H. E染色图(B， 100X)。图5是第10代可回复性永生化大鼠MSCs表面标志⑶34、⑶45、⑶90及⑶106的
流式细胞检测图。图6是可回复性永生化大鼠MSCs的SV40T基因可逆敲除的western blot图。图7是可回复性永生化大鼠MSCs的SV40T基因可逆敲除前后的细胞生长曲线图。图8是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时的光镜比较图。图9是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化过程中神经相关标志NSE的Western blot比较图。图10是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时神经相关标志 Nestin、NSE、MAPUDNF 的 Real-time PCR 比较图。图11是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时神经相关标志NestiruNSE、MAPUDNF的免疫荧光检测比较图。图12是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时神经样细胞的静息膜电位比较图。图13是可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体内移植治疗新生大鼠HIBD 的Morris水迷宫到达平台时间比较图。
图14是可回复性 永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体内移植治疗新生大鼠HIBD 的Morris水迷宫到达平台次数比较图。上述附图中出现的“MSCs”表示原代大鼠MSCs，“IMSCs”表示本发明的可回复性永生化大鼠MSCs，“ IMSCs Cre T Ag”表示被Cre重组酶敲除SV40T基因的可回复性永生化大鼠 MSCs。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。优选实施例中使用的SSR69质粒与pAmhpo质粒由芝加哥大学何通川教授馈赠。一、原代大鼠MSCs的分离培养与鉴定
取体重8(Tl50g的SPF级4、周龄SD大鼠(购自重庆医科大学动物中心)，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，用DMEM/F12培养基冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，按每瓶3 X IO6个细胞接种在25cm2的塑料培养瓶中，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基在温度为37°C、CO2体积分数为5%的条件下培养，24小时后倾去培养上清及未贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养，之后每3、天更换1次新鲜培养基，镜下观察，可见MSCs呈散在的细胞集落样生长，集落中央的细胞形态较圆，集落边缘的细胞为扁平梭形，培养Γ5 天细胞数量明显增加，集落逐渐扩大，6 7天细胞基本铺满瓶底，形态均一呈梭形漩涡状生长。当细胞长至80%汇合时，用TrypLE Express消化离心，按1 2或1 3的浓度传代，传代细胞均勻分布，生长迅速，约;Γ4天可铺满瓶底，细胞多呈梭形，漩涡状生长(图1)。流式细胞术鉴定大鼠MSCs的细胞表面标志取接近融合的第3代MSCs，用 TrypLE Express消化后，用pH7. 0的PBS洗涤3次，制成1 X 106/ml的单细胞悬液。取 100 μ 1细胞悬液5管a管为标准对照，加IgG1-FITC单克隆抗体；b管加⑶34-FITC单克隆抗体；c管加CD45-PE单克隆抗体；d管加CD90-PE单克隆抗体；e管加CD106-PE单克隆抗体；室温反应30分钟，流式细胞仪(FACSCanto II system, BD Biosciences)检测， CellQuest Pro software (BD Biosciences)分析，结果显示该细胞表达 CD90 (99. 99%)及 CD106 (99. 91%)，几乎不表达CD34 (3. 51%)及CD45 (2. 23%)(图2)，符合大鼠MSCs的生物学特性。二、携带SV40T基因的逆转录病毒的构建
将HEK293细胞接种于25cm2培养瓶，待融合度为60 70%时进行脂质体转染将SSR69 质粒 10μ1、ρΑπιρ1ιο 质粒 5Pl、Lipfectamine 2000 15μ1 和无血清无双抗 DMEM 培养基 250μ1 混合，室温孵育10分钟，制得转染混合液；将培养的293细胞用无血清无双抗DMEM培养基洗2次，加入无血清无双抗DMEM培养基2. 5ml，37°C放置10分钟，再加入上述转染混合液， 混勻，4飞小时后更换为DMEM完全培养基6ml。转染后24小时收集293细胞培养上清，该上清中即含有包装好的携带SV40T基因的逆转录病毒。三、可回复性永生化大鼠MSCs的构建、筛选与鉴定
取收集的293细胞培养上清(含有携带SV40T基因的逆转录病毒)，按每ml上清加入 2mg/ml polybrene 5μ1的比例加入polybrene，用孔径为0. 45Mm的滤器过滤，制得逆转录病毒培养液。将原代大鼠MSCs去除陈旧培养基，用上述逆转录病毒培养液培养过夜，再更换为新鲜培养基继续培养，同时设置未感染的原代大鼠MSCs作为对照细胞。于感染后第3 天，向细胞培养液中加入终浓度为4Pg/ml的潮霉素进行筛选，当细胞密度为90、5%时传代同时维持潮霉素的筛选浓度不变。筛选第4天，细胞开始明显生长缓慢，失去细胞原有的多角形形态，多数细胞慢慢变为长梭形，并在传代中不能贴壁，逐渐死亡；筛选2周左右，对照细胞全部死亡，经逆转录病毒感染处理的细胞仅5%存活；之后维持潮霉素的筛选浓度不变继续培养，存活细胞开始恢复正常的生长速度及状态(图3)，传代后细胞生长及形态无明显变化(图4)，则获得潮霉素抗性的MSCs，也即可回复性永生化大鼠MSCs。流式细胞术鉴定可回复性永生化大鼠MSCs的表面标志取接近融合的第10代可回复性永生化大鼠MSCs，用TrypLE Express消化后，用pH7. 0的PBS洗涤3次，制成 1 X 106/ml的单细胞悬液。取100 μ 1细胞悬液5管a管为标准对照，加IgG1-FITC单克隆抗体；b管加CD34-FITC单克隆抗体；c管加CD45-PE单克隆抗体；d管加CD90-PE单克隆抗体；e管加CD106-PE单克隆抗体；室温反应30分钟，流式细胞仪(FACSCanto II system, BD Biosciences)检测，CellQuest Pro software (BD Biosciences)分析，结果显示该细胞表达 CD90 (99. 84%)及 CD106 (99. 45%)，几乎不表达 CD34 (1. 32%)及 CD45 (4. 27%)(图 5)， 与原代大鼠MSCs比较无差异。四、可回复性永生化大鼠MSCs的SV40T基因的可逆敲除
将可回复性永生化大鼠MSCs按1 X 105/ml接种于6孔板，培养过夜，加入Cre重组酶腺病毒，同时设置空白对照组，并以原代大鼠MSCs作为阴性对照。48小时后提取各组细胞的总蛋白，BCA检测蛋白浓度，取等量蛋白上样(以β-actin为内参)，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，再80V电转移至PVDF膜上(电转移时间分别为SV40T蛋白90分钟、β-actin 40分钟)，用5%脱脂牛奶封膜1小时，分别加入一抗小鼠抗大鼠SV40T和小鼠抗大鼠β -actin (均用PBS按1 200稀释)，4°C孵育过夜，用TBST洗膜3次，再加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(用PBS按1 500稀释)，室温孵育1小时，再次洗膜后进行ECL发光检测。结果显示原代大鼠MSCs不表达SV40T蛋白，可回复性永生化大鼠MSCs表达大量的SV40T蛋白，而Cre 重组酶腺病毒感染可回复性永生化大鼠MSCs 48小时后，SV40T蛋白的表达回复到原代大鼠MSCs的表达水平(图6)，提示可回复性永生化大鼠MSCs的SV40T基因可被Cre重组酶敲除。将可回复性永生化大鼠MSCs按1 X 105/ml接种于6孔板，培养过夜，加入Cre重组酶腺病毒，同时设置空白对照组，并以原代大鼠MSCs作为阴性对照。分别于培养后第0、 1、2、3、4、5天计数细胞，绘制细胞生长曲线待计数细胞经胰酶消化、PBS洗涤后，加入培养液1ml，吹打制成细胞悬液，取100μ1细胞悬液到1.7ml离心管中，加入0. 4%台盼蓝染液 100μ1，吹打混勻，3飞分钟后取10μ1滴至计数板上，置显微镜下观 察计数。结果显示可回复性永生化大鼠MSCs的生长曲线呈S型，增殖明显快于原代大鼠MSCs (p<Q. 05)，而经Cre 重组酶敲除SV40T基因后，细胞增殖能力回复到原代大鼠MSCs的状态(图7)。五、可回复性永生化大鼠MSCs代替原代大鼠MSCs进行体外神经诱导分化的实验研究
将可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs分别按3X 104/ml接种于24孔板，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基培养，24小时后弃除完全培养基，用HBSS洗涤细胞2次，加入无血清MNM神经诱导液0. 5ml进行体外神经诱导分化，于不同时间点在倒置显微镜(TE2000-S，Nikon, Japan)下动态观察诱导前后的细胞形态学变化，拍照记录神经样细胞分化效率。结果显示诱导30分钟，原代大鼠MSCs和可回复性永生化大鼠MSCs均见大而扁平的胞体发生收缩；诱导60分钟，细胞折光性增强，逐渐收缩变成多级性的胞体，有许多细的指状突起；诱导3 24小时，细胞呈典型的神经元形态，有的细胞有多个长的突起， 多个神经样细胞的突起可相互延伸形成网状(图8)。原代大鼠MSCs和可回复性永生化大鼠MSCs的神经样细胞分化效率分别为51. 4%和57. 6%，无明显差异。Western blot检测可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs在体外神经诱导分化过程中神经相关标志NSE的表达将可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs按前述方法进行体外神经诱导分化，分别于诱导第0，6，12，18，24小时提取细胞总蛋白，取等量蛋白上样(以β-actin为内参)，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，再电转移至PVDF膜上， 用5%脱脂牛奶封膜1小时，分别加入一抗抗NSE(用PBS按1:200稀释)和抗β-actin (用PBS按1 500稀释)，4°C孵育过夜，洗膜，再加入HRP标记的二抗(用PBS按1 500稀释)，室温孵育广2小时，洗膜后进行ECL发光检测。结果显示，未诱导的原代大鼠MSCs不表达NSE，诱导后6小时开始表达NSE，并于24小时内逐渐增强；可回复性永生化大鼠MSCs 的NSE表达稍低于原代大鼠MSCs，但表达趋势一致(图9)。Real-time PCR检测可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs在体外神经诱导分化24小时神经相关标志Nestin、NSE、MAP-2、⑶NF的表达将可回复性永生化大鼠MSCs 与原代大鼠MSCs按前述方法体外神经诱导分化24小时，提取细胞总mRNA，逆转录成cDNA 模板，再分别采用5对特异性引物(Nestin :SEQ ID No. Γ2 ；NSE =SEQ ID No. 3 4 ;MAP_2 SEQ ID No. 5^6 ；GDNF :SEQ ID No. 7 8;内参 β-actin :SEQ ID No. 9 10)进行 real-time PCR，检测各神经标志的表达丰度；PCR反应体系为cDNA模板2μ1，10Mmol/L的上下游引物各 0. 5μ1，2. 5 X RealMasterMix/20 X SYBR solution 9μ1，加超纯水至 20μ1 ；PCR 循环参数为94°C 2分钟，94°C 20秒，56°C 20秒，72°C 20秒，共39个循环。结果显示可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时后，Nestin、NSE、MAP_2、⑶NF 的表达无显著差异(图10)。免疫荧光检测可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24 小时神经相关标志Nestin、NSE、MAP-2、⑶NF的表达将可回复性永生化大鼠MSCs与原代大鼠MSCs按前述方法体外神经诱导分化24小时，吸弃培养基，甲醇-20°C固定15分钟，PBS 洗涤3次，5%胎牛血清白蛋白封闭30分钟，PBS洗涤3次，分别加入一抗抗NSE (用PBS 按1 500稀释)、抗Nestin (用PBS按1 200稀释)、抗MAP-2 (用PBS按1 500稀释)和抗 ⑶NF (用PBS按1 300稀释)，4°C孵育过夜，PBS洗涤3次，再加入相应二抗，室温孵育2小时，PBS洗涤，DAPI复染胞核10分钟，荧光显微镜下观察并拍照。结果显示未经MNM神经诱导的原代大鼠MSCs与可回复性永生化大鼠MSCs均未见明显的荧光表达，经MNM诱导24 小时后，所得神经元样细胞均可见明显的NSE和Nestin在胞浆表达(绿色荧光)，MAP-2和 GDNF在胞浆及轴突表达(红色荧光)，两种细胞的神经相关标志表达无显著差异(图11)。全细胞膜片钳检测可回复性永生化大鼠MSCs及原代大鼠MSCs体外神经诱导分化24小时神经样细胞的静息膜电位将原代大鼠MSCs及可回复性永生化大鼠MSCs分别接种于直径为35mm的细胞培养皿上，按前述方法体外神经诱导分化24小时，选取折光性强、带有两个或多个长突起、胞体较圆的神经样细胞进行检测，同时以未经MNM神经诱导的原代大鼠MSCs及可回复性永生化大鼠MSCs作为对照(control)微电极外径1. 2mm、内径 0. 5mm，冲灌电极内液；电阻为2 5M，采样频率10kHz，低通滤波为IkHz ；采用高阻抗封接技术，负压打孔，形成细胞钳制；用AXOPATCH 200B放大器常法进行刺激发放和信号采集，记录全细胞静息膜电位。结果显示未经MNM神经诱导的原代大鼠MSCs及可回复性永生化大鼠MSCs的静息膜电位分别为-4. 825士 1. 121mV及-5. 057士 1. 115mV，经MNM诱导分化后，所得神经样细胞的静息膜电位分别为-36. 875 士8. 132mV及-39. 286 士6. 849 mV (图12)，两种细胞的静息膜电位无显著差异。 六、可回复性永生化大鼠MSCs代替原代大鼠MSCs进行体内移植治疗新生大鼠 HIBD的实验研究
构建新生大鼠HIBD模型取7日龄新生SD大鼠，参照Rice法，游离结扎左颈总动脉， 缝合切口，3小时后置密闭容器中，通氮气(保持氧的体积分数为纩9%) 2. 5小时。模型建立后1天，设立以下三组进行体内移植①PBS对照组；②原代大鼠MSCs移植组；③可回复性永生化大鼠MSCs移植组；将MSCs制成细胞悬液后，用微量注射器注入模型鼠腹腔，每只 100 μ 1 (含MSCs广2Χ106)。移植后，将三组鼠放回原饲养环境中喂养，不给予免疫抑制齐U。同时，以正常的新生SD大鼠作为对照组(control)。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆功能三组实验鼠在HIBD术后28天进行水迷宫实验。采用MWM水迷宫系统(SLY-WMS 2.0)直径为94cm的圆形水池，水深40cm， 水温25士 1°C ；以水池中点为圆心，将水池等分为四个象限(I、II、III和IV象限)；离池壁 20cm处放一个IOcmX 38cm的平台。第1天为可视训练，平台高于迷宫液面0. 5cm，平台中央以鲜艳小旗标示，随机于不同象限将实验鼠放入迷宫，由电脑自动记录动物从入水点到达平台所需时间，若动物在设定时间(60秒)内未找到平台，计算机停止跟踪并记录时间为60秒，同时将动物放在平台上停留10秒，共训练5次，每次间隔30分钟；第2飞天为非可视训练，平台低于迷宫液面2. 0cm,按照第1天的顺序从不同象限将实验鼠放入迷宫，未在设定时间内找到平台的时间记录及动物训练方式同第1天，每天训练6次，每次间隔60 分钟。第6天为平台探索检测，撤去平台，从平台所在象限的右侧象限将实验鼠放入迷宫， 记录实验鼠在规定时间内找到平台所在位置的次数及每次所需时间。结果显示与正常新生大鼠比较，HIBD新生大鼠的学习记忆功能下降，PBS对照组找到平台位置的次数明显减少，找到平台位置的时间明显延长05)，原代大鼠MSCs移植组和可回复性永生化大鼠 MSCs移植组找到平台位置的次数均显著多于PBS对照组，找到平台位置的时间均显著缩短 ip<Q. 05)，两个MSCs移植组间无明显差异(/7>0. 05)，说明MSCs移植可以改善HIBD新生大鼠的学习记忆功能，可回复性永生化大鼠MSCs能够替代原代大鼠MSCs体内移植治疗新生大鼠HIBD (图13 14)。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞，其特征在于，携带有SV40T基因及潮霉素抗性基因，所述SV40T基因的两端还有同向的Loxp位点。
2.权利要求1所述的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a.将逆转录病毒表达质粒SSR69与包装质粒pAmhpo共转染HEK293细胞，获得重组逆转录病毒；b.将步骤a所得重组逆转录病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞，用潮霉素进行筛选，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤b是将步骤a所得重组逆转录病毒感染第3代大鼠骨髓间充质干细胞，感染后第3天用浓度为4Pg/ml的潮霉素筛选2周，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞。
4.权利要求1所述的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞作为成神经诱导分化的种子细胞的应用。
5.权利要求1所述的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞作为治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的种子细胞的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞，其携带有SV40T基因及潮霉素抗性基因，SV40T基因的两端还有同向的Loxp位点；其制备方法是将SSR69质粒与pAmhpo质粒共转染HEK293细胞，获得重组逆转录病毒，再将该重组逆转录病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞，用潮霉素进行筛选，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞；该细胞具有与原代大鼠MSCs同样的生物学特性，还具有体外增殖能力强，生物学性状稳定，可回复到原有状态，生物安全性好等特点，可以作为成神经诱导分化的种子细胞以及治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的种子细胞应用。
文档编号C12N15/867GK102250841SQ201110183749
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者张赟, 李廷玉, 毕杨, 江伟, 陈洁, 魏小平, 龚敏 申请人:重庆医科大学附属儿童医院