专利名称：大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法和专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法和专用培养基。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于中胚层和外胚层的多潜能干细胞，按照发育过程分类属于成体干细胞。间充质干细胞和胚胎干细胞一样具有自我更新的能力，同时并具有向多 个胚层分化潜能，在特定诱导条件下能分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝细胞等多种组织细胞。间充质干细胞存在于多种组织中，目前已经从骨髓、月旨肪、肌肉等组织中成功获得了间充质干细胞。2001年，祖克(Zuk)从病人抽脂手术中的脂肪液中提取了一种具有自我更新和分化的间充质干细胞，这类干细胞被命名为脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)。脂肪来源间充质干细胞具有以下特点:(1)增殖能力强:体外培养第5代后可扩增100倍，且无明显衰老迹象。(2)免疫原性低:脂肪来源间充质干细胞在用于干细胞移植时，由于自体脂肪组织含量较高，所以多用于自体移植，所以其具有较低的免疫原性。(3)致肿瘤风险低:脂肪来源间充质干细胞具有稳定的端粒酶活性，在维持其增殖性的同时不具有致肿瘤性。近年来研究表明，ADSC细胞由于脂肪组织具有取材方便和干细胞含量较高等优势，同时在分化性能上，和骨髓来源的间充质干细胞基本相同，因此在干细胞进行受损的组织或器官的修复上具有广阔的应用前景。但是在脂肪来源间充质干细胞在从实验室走上临床应用，要面临干细胞的来源的不同会导致其自我更新以及分化能力的不同，因此寻找和对比多种脂肪来源可以丰富脂肪干细胞的组织来源。
发明内容
技术问题:鉴于现有的动物体内多个部位具有脂肪组织，因此本发明提出了一种从大鼠大网膜脂肪提取间充质干细胞的方法，同时提供一种能提取和长期维持大鼠大网膜脂肪来源带间充质干细胞活性的提取和培养液。使用本发明提取和培养的大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞在传至10代后仍能维持干细胞的活性，保持干细胞的较高的增殖能力和多个胚层方向分化潜能。技术方案:为解决上述技术问题，本发明公开了一种大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法，该方法包括如下步骤:步骤1:无菌条件下取健康斯泼累格 多雷(SD)大鼠的大网膜脂肪，剪碎成l_3mm3的小块；步骤2:用冰磷酸盐缓冲液混合后离心，去除部分脂肪组织；步骤3:1型和II混合胶原酶消化离心，去除上部脂肪细胞组织；步骤4:再次离心后用加入含有特定生长因子的培养基重悬后移入培养瓶中；
步骤5:培养瓶放入培养箱中持续传代培养。优选的,步骤I中，剪碎至l-3mm3。优选的，步骤2中，用4°C的磷酸盐缓冲液混合剪碎的脂肪组织后低速离心。优选的，步骤3中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶比例为1:1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1:1000，每克脂肪组织使用3ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，水浴消化时间为I小时，消化时水浴温度为37°C。本发明还提供了一种用于大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的培养基:该培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、胰岛素、大鼠重组成纤维生长因子、大鼠表皮生长因子、甲状腺原氨酸。优选的，基础培养基为低糖达尔伯克氏改良伊格尔的培养基百分比位94%、，添加胎牛血清的体积百分比为5%、抗生素体积百分比为1%、胰岛素lOug/ml、大鼠重组成纤维生长因子5ng/ml、大鼠表皮生长因子5ng/ml、甲状腺原氨酸10ng/ml。有益效果:本发明提供的提取和培养方法能快速获得大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞，并且能长时间维持干细胞的增殖和分化能力，在传代至第10代后获得的细胞仍然具有干细胞活性。
图1a为原代细胞第10天时细胞在明场下细胞形态，图1b为细胞培养第10代时干细胞在明场下细胞形态；图2a为干细胞表面标志蛋白⑶29流式细胞仪检测阳性结果；图2b为干细胞表面标志蛋白⑶44流式细胞仪检测阳性结果；图2c为干细胞表面标志蛋白⑶73流式细胞仪检测阳性结果；图2d为干细胞表面标志蛋白⑶106流式细胞仪检测阳性结果；图2e为干细胞表面标志蛋白⑶Ilb流式细胞仪检测阴性结果；图2f为干细胞表面标志蛋白CD31流式细胞仪检测阴性结果；图2g为干细胞表面标志蛋白CD45流式细胞仪检测阴性结果；图3a为向骨细胞分化的ALP染色检测；图3b为向脂肪细胞分化的明场显微镜检测；图3c为向神经细胞分化的明场显微镜检测。
具体实施例方式下面结合附图，对本发明做进一步说明。本发明提供的一种分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤:步骤1:取健康，体重大概为100_130g的斯泼累格 多雷(SD)大鼠，麻醉后无菌环境下从大鼠腹部侧面开3cm的切口，取大网膜脂肪。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脂肪组织数次，剪碎至1-3_3左右的小块。步骤2:加入PBS重悬，800rmp离心5分钟去除部分脂肪组织。步骤3:用I型和II胶原酶混合物消化、离心；
步骤5:消化I小时后800rmp离心5分钟去除上部脂肪细胞组织，加入PBS重悬，800rmp离心5分钟。步骤6:用培养液重悬沉淀后，用孔径为IOOum的无菌尼龙网过滤后计数，按照浓度为IO5个细胞每ml将过滤后单细胞悬液转移到培养瓶中放入培养箱温度为37°C、CO2浓度为5%、湿度为95%条件下培养7-10天。步骤7:干细胞克隆出现后，细胞按常规方法消化传代培养。步骤2中，用4°C的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的脂肪组织后低速离心步骤3中，加入的混合物为质量比为1:1的I型胶原酶和II型胶原酶以及PBS混合物，水浴消化0.5-2h，每克脂肪组织加入3ml胶原酶和PBS混合物，消化过程中间断振荡混匀组织块以促进消化，水浴消化时温度为37°C本发明提供的一种大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞专用培养基，由基础达尔伯克氏改良伊格尔培养基和添加成分组成:包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清的、抗生素(青霉素和链霉素)、胰岛素、大鼠重组成纤维生长因子、大鼠表皮生长因子、甲状腺原氨酸。具体成分配比为低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基体积百分比位94%、添加胎牛血清的体积百分比为5%、抗生素(青霉素和链霉素)体积百分比为1%、胰岛素浓度为lOug/ml、大鼠重组成纤维生长因子浓度为5ng/ml、大鼠表皮生长因子浓度为5ng/ml、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。实施例1大鼠大网膜提取脂肪来源间充质干细胞和使用专用培养基，包括以下步骤大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的专用培养基配制:在470ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入25ml胎牛血清、抗生素(青霉素和链霉素)5ml、胰岛素5mg、大鼠重组成纤维生长因子2.5ug、大鼠表皮`生长因子2.5ug、甲状腺原氨酸5ug，0.22 u m滤器过滤除菌，4°C储存备用。大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞提取与培养步骤:1、取健康、体重为100g_130g大鼠,麻醉后侧放置无菌手术台中,用无菌手术刀从大鼠腹部侧面剖开，取大网膜脂肪，质量大概为3g，放入预冷的PBS中，缝合创口。然后用PBS清洗数次洗掉残留血液，剪碎至Imm3左右的小块；2、加入PBS清洗，800rmp离心5分钟去除上侧大块脂肪组织；3、加入IOml I型胶原酶和II胶原酶混合物，密封EP管后放入37°C水浴消化lh，消化过程中每10分钟振荡组织块以促进消化；4、消化完成后800rmp离心5分钟去除悬浮大块脂肪组织，加入PBS清洗，800rmp离心5分钟一次；5、用含有自制培养基重悬后，用孔径为IOOum的无菌尼龙网过滤，将过滤后的单细胞溶液计数，按照浓度为105/ml将过滤液转移到培养瓶中放入培养箱37°C，5% CO2条件下培养；6、24h后，半量换液，48h后全量换液，第四天全量换液，观察细胞生长情况，一般10天后细胞成克隆生长，用0.25%的胰酶消化后，按照1:3的比例传代。图1:大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞原代细胞纯度较高，成克隆生长，在PlO代时，细胞纯度依然较高，且细胞活力以及分化能力依然较高。
实施例2:三代大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞表面抗原的鉴定。免疫表型检测:1、取第3代细胞分别用0.25%的胰酶消化后移入1.5ml离心管，800rmp离心5分
钟去除上清；2、每管加入Iml PBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；3、加入PBS重悬细胞，计数，调整细胞数为I X IO6个/ml ；4、将细胞悬液分为每管500 iU，选其中一管作为流式对照组；5、按组分别加入流式抗体，4°C避光孵育30分钟；6、800rmp离心5分钟去除上清；7、加入Iml PBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；8、加入500 U I PBS重悬细胞；9、流式细胞仪检测样品。图2:经流式细胞术检测，使用本发明方法培养的大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞均高表达⑶29、⑶44、⑶73，⑶106而⑶lib、⑶31、⑶45、呈阴性，表明经培养第10代后细胞仍表达间充质干细胞标志抗原，细胞仍保持干细胞特征。大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞向成骨，成脂肪，成神经诱导分化试验。提取的大鼠大网膜脂肪间充质干细胞向骨细胞，脂肪细胞，神经细胞分化能力检测:1、大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞向骨细胞分化能力检测。步骤为:正常培养后换成骨诱导液(低糖DMEM培养液，5%胎牛血清，1%双抗，5nM地塞米松，5nM维生素D3，5mM P -甘油磷酸钠，25 u M抗坏血酸及300mg/L L-谷氨酰胺)，此后每3天换液I次，连续换液诱导15天。采用碱性磷酸酶检测细胞向成骨细胞分化情况。步骤为:用PBS清洗细胞一次，后浸泡在4% (w/v)的多聚甲醒溶液中室温下固定30分钟。然后再用PBS漂洗一遍,浸泡在BCIP/NBT溶液中于室温下避光染色30分钟，最后用超纯水漂洗2遍除去残余溶液，放在倒置显微镜(Nikon T1-S)下观察。2、大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞向脂肪细胞分化能力检测。步骤为:正常培养后换成脂诱导液(低糖DMEM培养液，10%胎牛血清，1%双抗，IM地塞米松，I Oumo I/ml胰岛素，0.5mM IBMX及200uM吲哚美辛)，以后每3天换液I次，连续换液诱导15天。采用油红0染色鉴定细胞向脂肪细胞分化情况。步骤为:用PBS清洗细胞一次，接着用4%多聚甲醛于4°C固定30分钟。固定后，用油红0对进行染色。油红0溶于乙醇配成
0.5%的储存液,使用前用超纯水以2:3体积比稀释。样品与室温下在油红0溶液中染色15分钟后用超纯水洗3遍，去掉残余染液。放在倒置显微镜(Nikon T1-S)下观察。3、大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞向神经细胞分化能力检测。步骤为:正常培养后换成神经诱导液(低糖DMEM培养液，10%胎牛血清，1%双抗，2ug/ml全反式维甲酸RA)放在倒置显微镜(Nikon Ti_S)下观察细胞形态变化。图3表示在不同诱导剂下，干细胞向骨细胞，脂肪细胞，神经细胞分化检测情况。以上实例说明本技术提取的大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞可以作为一种干细胞的来源， 这一发明能有效的丰富脂肪来源干细胞的种类，为干细胞的近一步的科学研究和临床应用提供相关依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记 载的保护范围内。
权利要求
1.一种大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 步骤1:无菌条件下取健康康斯泼累格 多雷大鼠的大网膜脂肪，剪碎成l_3mm3的小块； 步骤2:用冰磷酸盐缓冲液混合后低速离心，去除部分脂肪组织； 步骤3:1型和II混合胶原酶消化离心，去除脂肪细胞组织； 步骤4:再次离心后用加入专用培养基重悬后移入培养瓶中； 步骤5:培养瓶放入培养箱中持续传代培养，干细胞成克隆生长后传代持续培养。
2.根据权利要求1所述的大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法，其特征在于:步骤2中，用4°C的磷酸盐缓冲液混合剪碎的脂肪组织后低速离心。
3.根据权利要求1所述的大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法，其特征在于:步骤3中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶比例为1:1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1: 1000，每克脂肪组织使用3ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，水浴消化时间为I小时，消化时水浴温度为37°C。
4.一种用于大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取的培养基，其特征在于:该培养基包括基础达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、胰岛素、大鼠重组成纤维生长因子、大鼠表皮生长因子、甲状腺原氨酸。
5.根据权利要求5所述的用于大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取的培养基，其特征在于:基础培养基为低糖达尔伯克氏改良伊格尔的培养基体积百分比位94%、，添加胎牛血清的体积百分比为5%、抗生素体积百分比为1%、胰岛素lOug/ml、大鼠重组成纤维生长因子5ng/ml、大鼠表皮 生长因子5ng/ml、甲状腺原氨酸10ng/ml。
全文摘要
本发明公开了一种分离提取大鼠大网膜脂肪间充质干细胞的方法和专用培养基。无菌条件下取健康斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠的大网膜脂肪，剪碎后用冰磷酸盐缓冲液混合后离心，去除部分脂肪组织。用I型和II混合胶原酶消化离心，去除上部脂肪细胞组织。再次离心后用加入含有特定化学物质和生长因子的专用培养基重悬后移入培养瓶中放入培养箱中持续传代培养。本发明在大鼠体内提出一种大网膜脂肪来源的间充质干细胞，同时在培养过程中通过添加特定的化学物质和生长因子的专用培养既可以解决干细胞在体外培养中容易衰老以及分化问题，获得了一种能长期保持干细胞特性的大网膜脂肪来源的间充质干细胞。
文档编号C12N5/0775GK103184191SQ20121051241
公开日2013年7月3日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者胡飞虎, 孙博, 肖忠党 申请人:东南大学