由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的制作方法

由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的制作方法
【专利摘要】本发明部分基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能(DA)神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明还提供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的试剂和试剂盒。
【专利说明】由人多能干细胞衍生神经干细胞和多己胺能神经元 发明领域
[0001] 本发明总体涉及干细胞并且更具体地涉及由人多能干细胞衍生神经干细胞和多 己胺能神经元的方法。
[0002] 背景信息
[0003] 人胚胎干巧巧细胞是可W分化成多个细胞类型的多能细胞。干细胞与其它细胞 类型的区别在于两个重要特征。第一，它们是有时在长期失活后，能够通过细胞分裂自我更 新的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可经诱导变成具有特定功能的组织 或器官特异性细胞。在一些器官，例如肠和骨髓中，干细胞定期分裂W修复和更换磨损或损 伤组织。然而，在其它器官，例如膜腺和也脏中，干细胞只在特定条件下分裂。
[0004] 胚胎发育期间，干细胞由3大主要细胞群形成机体组织；外胚层、中胚层和定形内 胚层。中胚层产生血细胞、内皮细胞、也肌和骨骼肌及脂肪细胞。定形内胚层生成肝脏、膜 腺和肺部。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。
[0005] 干细胞的潜在应用是产生用于医药疗法的细胞和组织。如今，常常将捐赠的器官 和组织用于置换患病或受损的器官和组织。不幸的是，需要移植物的人数远远超出可用于 移植的器官数量。干细胞提供了替代细胞和组织可再生源的可能性，W治疗大量疾病、病状 和残疾，包括帕金森氏症（Parkinson'Sdisease)、肌萎缩侧索硬化、脊髓损伤、烧伤、也脏 病、糖尿病和关节炎。
[0006] 帕金森氏症（PD)是由黑质致密部中的中脑多己胺（DA)神经元进行性变性引起的 神经障碍。DA神经元变性引起运动系统逐步机能失调，导致例如震颤、强直和运动徐缓等症 状。对于PD而言，目前尚无治愈并且虽然治疗例如深部脑刺激和左旋多己可W减轻一些症 状，但是它们往往随时间推移而失效。然而，黑质（SN)中DA神经元损失的局部特性使得细 胞替代疗法成为有吸引力的治疗帕金森氏症（PD)患者的方法。已经证实植入神经元细胞， 例如神经干细胞（NSC)和DA神经元改善了PD动物模型中的运动症状。为了使对PD的基 于干细胞的疗法变成现实，关键是能够生成将根据在患者脑部或在培养物中是否发生终末 分化，依次在原位或在体外生成功能性DA神经元的同源NSC群体。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明部分基于化学上定义的由人多能干细胞化PSC)生成神经干细胞（NSC)和 多己胺能（DA)神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明还提 供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多己胺能神经元的试剂和试剂盒。
[0009] 本发明提供通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理人多能干细胞化PSC)并 且测定细胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞（NSC)。本发明还提供经由稳定的NSC期 W稳健且可重现的方式由hPSC衍生高纯度DA神经元群，其中可使用新研发的化学定向分 化法扩增和冷藏细胞。
[0010] 在一个实施方案中，本发明提供了一种生成神经干细胞（NSC)的方法。所述方 法包括用检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞 化PSC)并且分析所述细胞的神经干细胞标志物。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另 一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomo;rphin、LD-193189或DMH-1。在特定方面，CKl抑制 剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomonhin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为 LD-193189 ;和CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0011] 一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0012] 一方面，神经干细胞标志物包括BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、 F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-UMAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6、TUBB3、SOXl、S0X2、S0X3 或 ST6GALNA巧或其任何组合。
[001引 另一方面，用SB218078和DMH-I处理hPSC。所得NCS表达LMXlA和F0X2A并且为 中脑腹侧神经外胚层细胞。中脑腹侧神经外胚层细胞为多己胺能神经元的前体。
[0014] 在一个实施方案中，本发明提供神经干细胞（NSC)。通过用检测点激酶1 (CKl)抑 制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC)并且分析所述细胞的神经 干细胞标志物生成主题NSC。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另一方面，BMP抑制剂可能 为DorsomoiiAin、LD-193189 或DMH-1。在特定方面，CKl抑制剂为SB218078 而BMP抑制 剂为Dorsomorphin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189 ;和CKl抑制剂为 SB218078 而BMP抑制剂为DMH-1。
[0015]一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0016] 在另一实施方案中，本发明提供了一种生成多己胺能神经元的方法。所述方法包 括用检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC); 通过测定经处理的hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞；用至少一种多己胺能神经 元诱导化合物处理NSC并且分析细胞的多己胺能神经元细胞标志物。在某些方面，CKl抑制 剂为SB218078并且BMP抑制剂为DorsomoiiAin、LD-193189或DMH-I。在一个优选方面， CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0017]一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0018] 在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 尸八8口7、尸0《42、尸(《04、6尸4口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、 S0X3或ST6GALNA巧或其任何组合。
[0019] 在所述方法的某些方面，多己胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、k半脫 亚賴酸、犬尿唾晰酸、（时-(+)-HA-966、间氯苯基双脈盐酸盐、巧蛋白酶抑制剂、Dimaprit 二盐酸盐、8-轻基-DPAT-氨漠酸盐、反式-4-轻基己豆酸、盐酸法舒地尔、喔普醜胺、视 黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215,001盐酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺脈隆、 肯泡隆化enpaullone)、CL218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺化巧、没药留丽 (Guggulsterone)Xh55、3-MATIDA、SEW2871、Immet虹idine二氨漠酸盐、LY364947、反苯 环丙胺盐酸盐、（-)-野說碱或尼鲁米特或其任何组合。在一个优选方面，多己胺能神经元 诱导化合物为没药留丽。
[0020] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元细胞标志物可能为TUJUTH、化tJoxa2、 Nurr-I、Girk2、MAPT、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl、PINKl、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-I、LMX1A、 ENl、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITXl或VMAT2 或其任何组合。
[0021] 另一实施方案中，本发明提供多己胺能神经元。通过用检测点激酶I(CKl)抑制 剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC);通过测定经处理的hPSC的 神经干细胞标志物鉴定神经干细胞；用至少一种多己胺能神经元诱导化合物处理NSC并且 分析细胞的多己胺能神经元细胞标志物生成主题DA神经元。在某些方面，CKl抑制剂为 SB218078 并且BMP抑制剂为Dorsomoi^phiruLD-igSlSg或DMH-1。在一个优选方面，CKl抑 制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0022]-方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0023] 在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 尸八8口7、尸0《42、尸(《04、6尸4口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、 S0X3或ST6GALNA巧或其任何组合。
[0024] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、k半脫亚 賴酸、犬尿唾晰酸、（R)-(+)-HA-966、间氯苯基双脈盐酸盐、巧蛋白酶抑制剂、Dimaprit二 盐酸盐、8-轻基-DPAT-氨漠酸盐、反式-4-轻基己豆酸、盐酸法舒地尔、喔普醜胺、视黄酸、 AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215,OOl盐酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺脈隆、肯泡隆、化 218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺化巧、没药留丽、Ch55、3-MATIDA、SEW2871、 Immet虹idine二氨漠酸盐、LY364947、反苯环丙胺盐酸盐、（-)-野說碱或尼鲁米特或其任 何组合。在一个优选方面，多己胺能神经元诱导化合物为没药留丽。
[00巧]在所述方法的再一方面，多己胺能神经元细胞标志物可能为TUJUTH、化tJoxa2、Nurr-I、Girk2、MAPT、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl、PINKl、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-I、LMX1A、 EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1 或VMAT2 或其任何组合。
[0026] 在另一实施方案中，本发明提供了用于衍生NSC的试剂盒。所述试剂盒包括检测 点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂、鉴定神经干细胞标志物的试剂和由 hPSC生成NSC的说明书。一方面，CKl抑制剂为SB218078并且BMP抑制剂为DorsomoiDhin、 LD-193189或DMH-I。在某些方面，CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomo^hin; CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189 ;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂 为DMH-I。所述试剂盒可W包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、 6尸八口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、01《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、5(?3或5166411^(：5 神经干细胞标志物的试剂。
[0027] 在另一实施方案中，本发明提供了用于生成多己胺能神经元的试剂盒。所述试剂 盒包括检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂；鉴定神经干细胞标志 物的试剂；至少一种多己胺能神经元诱导化合物；鉴定多己胺能神经元干细胞标志物的试 齐U;和由hPSC生成多己胺能神经元的说明书。一方面，CKl抑制剂为SB218078,BMP抑制 剂为DMH-I并且多己胺能神经元诱导化合物为没药留丽。所述试剂盒可W包括鉴定BRN2、 CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、0TX2、 PAX6、TUBB3、S0X1、S0X2、S0X3或ST6GALNA巧神经干细胞标志物的试剂。所述试剂盒还可 W包括鉴定TUJ1、TH、Dat、化xa2、Nurr-UGirk2、MAPT、SYT4、F0XA1、孤C、AS化 1、PINK1、 PAX5、LMXlB、PITX3、NURR-I、LMX1A、ENl、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITXl或VMAT2 多 己胺能神经元细胞标志物的试剂。
[0028] 另一实施方案中，本发明提供了神经疾病和病症的治疗方法。所述方法包括向有 神经疾病或病症的受试者施用NSC。
[0029] 再一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病或病症的方法。所述方法包括向有 神经疾病或病症的受试者施用NSC或DA神经元。
[0030] 附图简述
[0031]图1描绘了高通量神经诱导小分子筛选测定。将未分化的无饲养层hPSC接种在 96孔板中，用小分子处理，然后固定并对PAX6表达染色。
[0032] 图2为显示对经小分子处理的hPSC筛选PAX6表达的图。用与Dorsomo巧bin组 合的SB218078处理产生PAX6的高表达。
[0033] 图 3 为显示通过RT-PCR在经SB218078 和Dorsomo^MruDMH-I或LD193189 处理 的hPSC上表达Sox1、Sox2、化x6、0tx2、Lmx1 和化x2A的图。
[0034] 图4显示在第7代时对hPSC衍生的NSC的FAC分析，证明了巢蛋白和musashil 的表达。
[00巧]图5A-F显示通过小分子生成hPSC衍生的NSC。（A)显示hPSC神经诱导的小分 子筛选策略的图解。炬）用SB218078和DMHl处理7天并且对PAX6染色的hPSC。比例尺 为100ym。似对巢蛋白、Musashi和PAX6染色的扩增hPSC-NSC。比例尺为100ym。（D) 对Musashi、巢蛋白、PAX6和0CT4染色的hPSC-NSC群的FACS分析。似显示从hPSC到 NSC成倍表达诱导神经标志物的基因表达微阵列分析；n=2。（巧通过RT-PCR对hPSC和 hPSC-NSC的基因表达分析。平均数+平均数标准误差，双尾学生t检验；n=3-5 ;a= 0. 05;*冲<0.Ol;冲<0. 05。
[0036] 图6A-K显示没药留丽促进DA神经元的生成。（A)显示hPSC衍生的NSCQiPSC-NSC) 分化为DA神经元的小分子筛选策略的图解。炬）没药留丽佑巧处理30天后对多己胺能标 志物的染色。比例尺为IOOym。（C)对TH染色的衍生DA神经元的FACS分析。（D)通过 基因表达微阵列分析测定，多己胺能标志物从NSC到DA神经元的成倍诱导；n= 2 (巧通过 RT-PCR分析的DA神经元、NSC和未分化hPSC中的相对基因表达。平均数+平均数标准误 差，单因素AN0VA，用Dunnett检验将DA神经元和NSC的表达与hPSC对照比较；n= 3-5 ;a =0. 05 ;**冲<0.OOl;*冲<0.Ol;冲<0. 05。（巧经GS处理的神经元与对照细胞（用lOOng/ mlFGW和2yM嘿吗啡胺（purmo巧hamine)处理1周并且用0. 1 %DMSO代替GS处理2 周的NSC)的多己胺释放测定。平均数+平均数标准误差，双尾学生t检验；n= 3 ;a= 0. 05 ;*冲<0. 01。佑）全细胞膜片谢制GS处理神经元的代表性相衬图像。比例尺为10ym。 化）在电压谢模式中对似中的细胞应用从-60到+50mV的电压斜升引起的轴电流。斜升 参数和波形叠加在电流轨迹上W红色示出。蓝色箭头指刺激斜升跨过OmV值的点。（I)在 电流谢模式中，通过注射5(K)pA，200ms，由（g)中的细胞引起的动作电位。在20个膜片谢细 胞中的7个发现动作电位。（J)经GS处理的神经元的细胞外微电极阵列（MEA)记录，显示 3个代表性电极的IOs电压轨迹。在右边扩增了每个电极的单个峰。化）（j)中电极的峰峰 间隔直方图，显示：（II)与爆发中峰间间隔相关的峰值；（I)爆发间期或非爆发电极上 单个峰之间的较长间隔的峰值。进行记录，一式两份。
[0037] 发明详述
[003引本发明部分基于由人多能干细胞化PSC)生成神经干细胞（NSC)和多己胺能（DA) 神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明还提供了用于由人 多能干细胞衍生神经干细胞和多己胺能神经元的试剂和试剂盒。
[0039] 在描述本组合物和方法之前，应理解本发明不限于描述的特定组合物、方法和实 验条件，正因如此组合物、方法和条件可能不同。还应理解，本文使用的术语仅仅是为了描 述特定实施方案，而非旨在限制，因为只在所附权利要求中限制本发明的范围。
[0040] 如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文明确另外指出，单数形式"一种"、 "一个"和"所述"包括复数个指示物。因此，例如，提到"所述方法"包括一种或多种方法， 和/或对于本领域的技术人员而言在阅读本公开后将变得显而易见的本文所述类型的步 骤等。
[0041]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普 通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实践或试验中可使用与本文所述相似 或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。
[0042] 本发明提供通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理hPSC并且测定所述细胞 的神经干细胞标志物衍生神经干细胞（NSC)。本发明还提供经由稳定的NSC期W稳健且可 重现的方式由hPSC衍生高纯度DA神经元群，其中可使用新研发的化学定向分化法扩增和 冷藏细胞。
[0043] 由人多能干细胞化PSC)，包括但不限于人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞 OipSC)、诱导型多能干细胞（iPSC)生成神经干细胞（NSC)是基于细胞的用于治疗神经疾病 的策略的重要组成部分。然而，可在治疗方式中施用hPSC衍生的NSC之前，必须研发可重 现且稳健地诱导NSC生成的化学定义的培养条件。此处，进行高通量筛选W鉴定诱导hPSC 分化为NSC的小分子。由筛选鉴定出小分子SB218078,报道的检测点激酶1 (CKl)抑制剂， 并且用于研发使hPSC分化为NSC的化学定义的分化法。
[0044] 本文报道的化学方法提供由可进一步分化成成熟神经元，用于细胞疗法或药物发 现的hPSC生成同源NSC群体。
[0045] 由人多能干细胞化PSC)，包括但不限于人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞 OipSC)、诱导型多能干细胞（iPSC)生成多己胺能细胞（DC)是基于细胞的用于治疗帕金森 氏症的策略的重要组成部分。然而，可在治疗方式中施用hPSC衍生的DC之前，必须研发可 重现且稳健地诱导多己胺能细胞分化的化学定义的培养条件。进行高通量筛选W鉴定诱导 hPSC衍生的神经干细胞化PSC-NSC)分化为多己胺能（DA)神经元的小分子。由筛选鉴定出 小分子，然后用于研发使hPSC-NSC分化为多己胺能细胞的化学定义的分化法。
[0046] 本文报道的化学方法提供了由hPSC生成可用于神经疾病细胞疗法（例如帕金森 氏症）或药物发现的多己胺能神经元的说明。另外，发现本文报道为多己胺能细胞分化的 诱导剂的小分子具有有效的体外人多己胺神经元神经保护作用并且可用于预防神经疾病 (例如帕金森氏症）和/或神经疾病（例如帕金森氏症）的进展。
[0047] 已经鉴定了调节人多能干细胞向DA神经元的逐步分化的新的小分子。发现类固 醇，没药留丽，为神经干细胞向DA神经元最有效的诱导剂。该些神经元受广泛表征并且证 实具功能性。该种新方法提供了产生用于治疗神经疾病患者的足够质量的神经元的实用途 径。
[004引本文公开了衍生神经干细胞（NSC)、多己胺能（DA)神经元的方法并且所得干细胞 和本文所述的神经元由人多能干细胞化PSC)，例如胚胎干细胞生成。如本文所使用，"胚 胎"指W单合子开始而W不再包含除已发育配子细胞外的多能或全能细胞的多细胞结构结 束的一系列生物发育期。除通过配子融合衍生的胚胎外，术语"胚胎"指通过体细胞核转 移衍生的胚胎。可使用本领域已知的方法在培养中将人干细胞维持在无实质性分化的多 能状态。例如，在美国专利第 5, 453, 357、5, 670, 372、5, 690, 926、5, 843, 780、6, 200, 806 和 6, 251，671号中描述了此类方法，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0049] 如本文所使用，"专能"或"专能细胞"指可产生数量有限的其它特定细胞类型的细 胞类型。专能细胞的实例包括可产生数量有限的其它细胞的外胚层细胞、内胚层细胞、中胚 层细胞和神经干细胞。
[0050] 如本文所使用，"多能干细胞"指可在体外更长、理论上无限的时期维持呈未分化 状态，可产生不同分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层的细胞。人多能干细胞化PSC) 包括但不限于人胚胎干细胞OiESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)和诱导型多能干细胞 (iPSC)。获得此类hPSC的方法在本领域中众所周知。
[005。获得hPSC的一种方法为通过孤雌生殖。"孤雌生殖单性生殖激活"和"孤雌 生殖激活"在本文中可交换使用）指在没有精子穿入时发生卵母细胞激活的过程，并且指包 含滋养外胚层和内细胞群的早期胚胎发育，早期胚胎通过激活卵母细胞或胚胎细胞，例如 包含全部雌性来源的DNA的卵裂球获得。在一个相关方面，"单性生殖生物"指通过该样激 活获得的所得细胞。在另一个相关方面，"胚泡"指包含由外滋养层细胞和内细胞群（ICM) 构成的空也细胞球的受精或激活卵母细胞的卵裂阶段。再一相关方面，"胚泡形成"指卵母 细胞受精或激活后，随后在培养基中将卵母细胞培养一段时间W使其能够发育成由外滋养 层细胞和ICM构成的空也细胞球的过程（例如，5至6天）。
[0052]获得hPSC的另一种方法为通过核转移。如本文所使用，"核转移"指供体细胞或来 自供体细胞的DNA向适合受体细胞的融合或移植，受体细胞通常为移植或融合之前、同时 或之后经处理W去除或灭活其内源性核DNA的相同或不同物种的卵母细胞。用于核转移的 供体细胞包括胚胎细胞和分化细胞，例如体细胞和生殖细胞。供体细胞可能处于增殖细胞 周期（G1、G2、S或M)或非增殖（GO或静止）期。优选地，供体细胞或来自供体细胞的DNA 源自增殖哺乳动物细胞培养物，例如成纤维细胞培养物。供体细胞可任选经转基因，即，其 可能包含一个或多个基因添加、取代或缺失修饰。
[0053] 获得hPSC的另一种方法是通过细胞重编程W获得诱导型多能干细胞。Tak址ashi 等（Cell131,861-872(2007))已经公开了用于不使用任何胚胎或ES(胚胎干）细胞重编 程分化细胞，并且建立具有与ES细胞相似的多能性和生长能力的诱导型多能干细胞的方 法。Tak址ashi等描述了已分化成纤维细胞的各种不同核重编程因子，其包括W下4个基因 的产物=Oct家族基因；Sox家族基因；Klf家族基因；和Myc家族基因。
[0054] 优选通过在适当条件下培养细胞，例如通过在成纤维细胞饲养层或包括白血病抑 制因子（LI巧的另一饲养层或培养物上培养维持细胞的多能状态。该样培养的细胞的多能 状态可通过各种方法确认，例如（i)确认多能细胞特有的标志物的表达；（ii)产生含有表 达多能细胞基因型的细胞的嵌合动物；（iii)将细胞注入动物，例如SCID小鼠体内，在体外 产生不同分化细胞类型；和（iv)观察体外细胞（例如，当在没有饲养层或LIF培养的情况 下时）向胚状体和其它分化细胞类型的分化。
[0055] 用于本发明的细胞的多能状态可通过各种方法确认。例如，可测试细胞的特有ES 细胞标志物的存在或缺乏。就人ES细胞而言，W上鉴定了此类标志物的实例，并且包括 SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81 和OCT4,并且在本领域中已知。
[0056] 同样，可通过将所述细胞注入适合动物例如SCID小鼠体内，并且观察分化细胞和 组织的产生确认多能性。确认多能性的另一种方法是使用主题多能细胞生成嵌合动物并观 察引入细胞对不同细胞类型的贡献。
[0057] 确认多能性的再一种方法是当在有利于分化的条件下（例如，去除成纤维细胞饲 养层）培养时，观察ES细胞向胚状体和其它分化细胞类型的分化。已经利用了该种方法并 且已经确认主题多能细胞在组织培养中产生胚状体和不同分化细胞类型。
[0058] 所得多能细胞和细胞系，优选人多能细胞和细胞系，具有许多治疗和诊断应用。 此类多能细胞可在许多疾病状况的治疗中用于细胞移植疗法或基因疗法（如果经遗传修 饰）。
[0059] 人多能干细胞化PSC)包括但不限于人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导型多 能干细胞和由此类细胞产生的细胞系。在培养中通过常规传代维持hPSC呈多能状态，直至 需要衍生神经干细胞。
[0060] "NSC"(也称为"专能神经干细胞"）展现出下列一种或多种性质；1)表达巢蛋白； 2)表达Sox2 ;3)表达Musashil;4)作为单层细胞或在息浮培养中作为神经球，进行自我 更新的能力；5)分化成神经元、神经元的特定亚型、星形细胞和少突胶质细胞的能力；和6) NSC典型的形态特征。
[0061]NSC为产生神经系统的主要表现型的自我更新、专能细胞。NSC主要分化成神经 元、星形细胞和少突胶质细胞。
[0062] 神经外胚层（Neuroectoderm)(或神经外胚层（neuralectoderm)或神经管上皮） 是从蛋白质例如诺金（noggin)接收骨形态发生蛋白抑制信号，导致来自该组织的神经系 统发育的外胚层的术语。从外胚层募集后，神经外胚层经历3个发育阶段；转化成神经板、 转化成神经沟（与神经權相关）和转化成神经管。所述管形成后，大脑形成3个部分：后 脑、中脑和前脑。
[0063] 可通过检测神经干细胞标志物的表达增强鉴定神经干细胞，神经干细胞标志 物包括但不限于；ABCG2、AS化1/Mashl、目-III微管蛋白、BMI-1、化gl、BRN2、CDCP1、 CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP、FABP7/B-SLAIN1、FABP8/M-FABP、FGFR4、F0XA2、F0X04、 化izzled-9、GFAP、Glutl、册XB1、LMX1A、MAP2、Musashi-1、Musashi-2、巢蛋白、NeuroDl、 诺金、Notch-1、Notch-2、核干因子（Nucleostemin)、少突胶质细胞标志物04、0TX2、PAX6、 PDGFRa、凸素 2(Prominin2)、SOX1、S0X2、S0X3、S0X9、SOX11、S0X21、SSEA-1、ST6GALNAC5、 TUBB3、TRAF-4 和 / 或波形蛋白（Vimentin)D
[0064] 巢蛋白是有用的标志物，因为虽然其主要在中枢神经系统（CN巧的干细胞中表 达，但是在几乎所有成熟CNS细胞中不存在其表达。已知转录因子S0X2在发育CNS的神经 上皮中高水平表达并且认为对神经干细胞增殖和分化非常重要。
[0065] 本发明提供了通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理hPSC并且测定所述细 胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞（NSC)的方法。
[0066] 在一个实施方案中，本发明提供了一种生成神经干细胞（NSC)的方法。所述方 法包括用检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞 化PSC)并且分析所述细胞的神经干细胞标志物。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另 一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomoi^phiruLD-igSlSg或DMH-1。在特定方面，CKl抑制 剂为SB218078而BMP抑制剂为DorsomoiDhin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为 LD-193189 ;和CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0067] 一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0068] 一方面，神经干细胞标志物包括BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、 F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-UMAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6、TUBB3、SOXl、S0X2、S0X3 或 ST6GALNA巧或其组合。
[0069] 如实施例中所证明，本发明提供了表达BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、 F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-UMAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6,TUBB3、SOXl、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 的NSC。
[0070] 如本文所使用，"神经干细胞诱导化合物"为诱导hPSC变成NSC的化合物。此类化 合物包括但不限于检测点激酶抑制剂和骨形态发生蛋白抑制剂。
[0(m] 检测点激酶1 (化kl)在细胞周期G2过渡的调节中起重要作用。响应于DNA损伤激 活GUS和G2的3个检测点。可用一些化学试剂或通过福射或在DNA复制期间诱导DNA损 伤。检测点的作用是在发生DNA损伤时延迟细胞周期进程，W便为DNA修复提供时间。Gl/ S检测点依赖于p53。在DNA损伤的存在下，发生对p53活性的快速诱导，诱导细胞周期蛋 白依赖性激酶抑制和细胞周期阻滞W防止S期期间复制受损DNA。在缺乏Gl检测点的p53 突变细胞中，仅G2检测点能够提供允许激活DNA修复途径的细胞周期进程延迟。化kl抑制 剂消除了G2检测点。
[0072]CKl抑制剂的实例包括但不限于SB-218078、己快二醇（Hymenialdisine)、 脱漠己快二醇（Debromohymenialdisine)、PD0166285、13-轻基-15-〇xozoapat系、 granulatimide、isogranulatimide和S27888。
[0073] 骨形态发生蛋白炬M巧是属于转化生长因子目（TGF目）超家族的多功能生长因 子。最初通过其诱导骨和软骨形成的能力发现，现在认为BMP构成了一组关键的形态发生 信号，编排整个身体的组织架构。BMP与细胞表面称为骨形态发生蛋白受体炬MPR)的特定 受体相互作用。通过BMPR的信号转导导致SMAD蛋白家族的成员活动。牵涉BMP、BMra和 Smad的信号通路在也脏、中枢神经系统和软骨的发育W及产后骨发育中是重要的。它们在 胚胎发育期间对胚胎模式和早期骨骼形成具有重要作用。BMP信号在也脏、神经和软骨发育 中起关键作用。
[0074]BMP抑制剂的实例包括但不限于DorsomoiiAin、LD-193189和DMH-1。
[00巧]可使用本领域中技术人员众所周知的方法容易地鉴定由hPSC衍生的NSC。该些方 法包括使用免疫组织化学法、FACS分析和RNA表达水平的测量鉴定神经干细胞标志物。 [0076]在一个实施方案中，本发明提供神经干细胞。通过用检测点激酶I(CKl)抑制剂 和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC)并且分析所述细胞的神经干 细胞标志物生成主题NSC。一方面，CKl抑制剂为SB218078。另一方面，BMP抑制剂可能 为Dorsomorphin、LD-193189 或DMH-1。在特定方面，CKl抑制剂为SB218078 而BMP抑制 剂为Dorsomonhin;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189 ;和CKl抑制剂为 SB218078 而BMP抑制剂为DMH-1。
[0077]-方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0078] 一方面，NSC表达可为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、 LMX1A、Musashi-I、MAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6、TUBB3、SOXl、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 或其 任何组合的神经干细胞标志物。
[0079] 另一方面，用SB218078和DMH-I处理hPSC。所得NCS表达LMXlA和F0X2A并且是 中脑腹侧神经外胚层细胞。中脑腹侧神经外胚层细胞为多己胺能神经元的前体。
[0080] -旦衍生NSC，就可在体外维持所述细胞更长、理论上无限的时期，保持其分化成 其它神经细胞类型，例如星形细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。如实施例中所述，可使 hPSC衍生的NSC在基质胶涂层板上于NSC培养基中生长至少7代。
[0081] 如实施例中所示，使用高通量筛选策略鉴定了两种有效的神经诱导剂，SB218078 和DMH-I(图 5A)。hPSC衍生的NSCOiPSC-NSC)群体对巢蛋白、Musashi-UPAX6、FABP7、 BRN2、S0X3、ST6GALNAC5、CXCR4、DCX、肥S、MSI、CD113、CD15、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、 MAP2、0TX2、TUBB3、S0X1、S0X2和ST6GALNAC5神经干细胞标志物呈阳性而对0CT4和NANOG 多能性标志物呈阴性（图3、5B、5C、5D和5F)。FABP7编码CNS发育中牵涉的脑脂肪酸结合 蛋白并且在NSC中高度表达。ST6GALNA巧编码介导细胞通过血脑屏障的通道的a2, 6-唾 液酸转移酶。进一步地，使用SB218078和DMH-I衍生的NSC表达LMXlA和F0X2A。在为多 己胺能神经元前体的中脑腹侧神经外胚层细胞上表达LMXlA和F0X2A。该些NSC适于进一 步扩增、冷藏和分化，使其成为DA神经元的实用来源。正因如此，本发明证明公开的方法由 hPSC生成NSC。
[0082] 本发明还提供在限定化学条件下由hPSC生成多己胺能神经元。
[0083] 如本文所使用，"分化"指细胞中发生的使那些细胞呈现某些特化功能并且失去变 成某些其它特化功能单元的能力的变化。能够分化的细胞可能为全能细胞、多能细胞或专 能细胞的任一种。就成熟的成体细胞而言，分化可能是部分或完全的。
[0084]"分化细胞"指具有特定分化（即，非胚胎）状态的非胚胎细胞。H种最早分化的 细胞类型为内胚层、中胚层和外胚层。
[00财由hPSC衍生的NSC为专能性并且可分化成几种神经细胞类型，包括神经元、星形 细胞和少突胶质细胞。
[0086] 星形细胞，也统称为星形神经胶质，是大脑和脊髓中的特有星形胶质细胞。它们是 人大脑最丰富的细胞。它们执行许多功能，包括对形成血脑屏障的内皮细胞的生物化学支 持，为神经组织提供营养，维持细胞外离子平衡和在跌打损伤后在大脑和脊髓的修复和疲 瘤形成过程中的作用。
[0087] 神经元是通过电和化学信号加工并传递信息的电可兴奋性细胞。化学信号经由突 触，与其它细胞的特化连接产生。神经元相互连接形成神经网络。神经元是神经系统的核 也组分，神经系统包括大脑、脊髓和外周神经节。存在许多特化类型的神经元；感觉神经元 对触摸、声音、光和影响感觉器官的细胞的许多其它刺激响应，然后感觉器官的细胞向脊髓 和大脑发送信号。运动神经元接收来自大脑和脊髓的信号，使肌肉收缩并影响腺体。中间 神经元将神经元连接到大脑或脊髓相同区域内的其它神经元。存在几种类型的神经元；胆 碱能、GABA能、谷氨酸能、多己胺能和血清素能（Serotonergic)。
[008引胆碱能神经元。己醜胆碱从突触前神经元释放到突触间隙。其用作配体口控离子 通道和代谢型（GPCR)覃毒碱受体的配体。烟碱受体是由结合烟碱的a和目亚基构成的 五聚体配体口控离子通道。配体结合打开引起Na+流去极化的通道并且增加了突触前神经 递质释放的可能性。
[0089]GABA能神经元-Y氨基下酸。GABA是CNS中两种神经抑制剂之一，另一种是甘氨 酸。GABA具有A化，允许a-离子进入突触后神经元的口控阴离子通道的同源功能。a-离 子在神经元中引起超极化，降低了当电压变为更大负值时，动作电位放电的可能性（记得 对于放电的动作电位而言，必须达到正电压阔值）。
[0090] 谷氨酸能神经元。谷氨酸是两种主要兴奋性氨基酸之一，另一种为天冬氨酸。谷 氨酸受体是4大类之一，其中3类为配体口控离子通道而另一类为G蛋白偶联受体（常常 称为GPCR)。AMPA和红藻氨酸化ainate)受体均起到对介导快速兴奋性突触传递的化+阳 离子通道有渗透性的阳离子通道的作用。NMDA受体是对Ca"更有渗透性的另一种阳离子 通道。NMDA受体的功能取决于通道孔内作为协同激动剂的甘氨酸受体结合。NMDA受体在 没有两种配体存在时不起作用。代谢型受体，GPCR调节突触传递和突触后兴奋性。当阻断 进入大脑的血流时，谷氨酸可引起兴奋性中毒，导致脑损伤。当压制血流时，谷氨酸从突触 前神经元释放，使NMDA和AMPA受体比在没有应力条件时通常如此的激活程度更高，导致进 入突触后神经元的Ca2+和Na+增多和细胞损伤。
[00川多己胺能神经元。多己胺是对增加cAMP和PKA的Dl类型（Dl和D5)Gs偶联受体 和激活减少cAMP和PKA的Gi偶联受体的D2类型值2、D3和D4)受体起作用的神经递质。 多己胺与情绪和行为相关联，并且调节突触前和突触后神经传递。已经将黑质中多己胺神 经元的缺失与帕金森氏症联系起来。
[0092] 血清素能神经元。血清素，（5-轻色胺，5-HT)可作为兴奋性或抑制性。四个5-HT 受体类别中，H类为GPCR而一类为配体口控阳离子通道。通过色氨酸轻化酶由色氨酸合 成血清素，然后进一步通过芳香酸脱駿酶合成。已经将突触后神经元处5-HT的缺乏与抑 郁联系起来。阻滞突触前血清素转运体的药物用于治疗，例如百优解（Prozac)和左洛复 (Zoloft)O
[0093] 少突胶质细胞是另一类型的脑细胞。少突胶质细胞的主要功能是提供支持和隔离 一些脊椎动物的中枢神经系统（大脑和脊髓）中的轴突（神经细胞的长突出部分）。少突 胶质细胞通过产生为80%脂质和20%蛋白质的髓銷该样做。单个少突胶质细胞可将其突 出延伸到50个轴突，将约Iym髓銷包裹在每个轴突周围。每个少突胶质细胞为几个相邻 轴突形成一段髓磯脂。
[0094] 在恰当培养条件下，可诱导主题NSC表达特定神经基因，例如中脑多己胺能谱系 的基因，例如Nurrl和Pitx3。
[0095] 可诱导主题NSC分化成表达酪氨酸轻化酶（TH)的神经元。TH是多己胺能神经元 的已知标志物。在一些实施方案中，主题NSC分化成运动神经元，其中运动神经元对皿9呈 阳性。在一些实施方案中，主题NSC分化成GABA能神经元，其中GABA能神经元对GAD67呈 阳性。在一些实施方案中，主题诱导型NSC分化成多己胺能神经元，其中多己胺能神经元为TH阳性。
[0096] 可通过表达神经元标志物化jl(目-III-微管蛋白）；MAP-2(微管相关蛋白2， 也可使用其它MAP基因例如MAP-I或-5);抗轴突生长克隆系；ChAT(胆碱己醜转移酶）； CgA(抗嗜铅粒蛋白A);DARRP(多己胺和cAMP调节磯蛋白）；DAT(多己胺转运体）；GAD(谷 氨酸脱駿酶）；GAP(生长相关蛋白）；抗化C蛋白；抗化D蛋白；.a.-互联蛋白；NeuN(神 经元特异性核蛋白）；NF(神经丝）；NGF(神经生长因子）；.y.-SE(神经元特异性帰醇化 酶）；外周蛋白；P服；PGP(蛋白质基因产物）；SERT(血清素转运体）；突触蛋白；Tau(神经 原纤维缠结蛋白）；抗化y-1 ;TRK(酪氨酸激酶受体）；TRH(色氨酸轻化酶）；抗TUC蛋白； TH(酪氨酸轻化酶）；V化（辣椒素受体样蛋白）；VGAT(囊泡GABA转运体）、VGLUT(囊泡谷 氨酸转运体）鉴定神经元。
[0097] 可根据功能标准测试通过诱导主题NSC分化生成的神经元。例如，可通过任何标 准技术，响应于神经递质或已知影响体内神经元的其它环境条件测量巧流量。首先，按形态 标准，或通过标志物例如NCAM鉴定群体中的神经元样细胞。然后将所述神经递质或条件施 加于所述细胞，并监测反应。还使所述细胞经受标准膜片谢技术，W确定是否存在动作电 位的证据，和外加电位与反应之间存在何种滞后时间。主题NSC的分化可产生含有具有呈 NCAM或MAP-2阳性的神经元的形态特征并且对GABA、己醜胆碱、ATP和高轴浓度、谷氨酸、 甘氨酸、抗坏血酸、多己胺或去甲肾上腺素的一种或多种显示出反应的亚种群的培养物。在 一些实施方案中，主题分化NCAM或MAP-2阳性细胞还在膜片谢系统中展现出动作电位。
[0098] 多己胺能神经元的标志物包括但不限于TUJ1、TH、化t、化xa2、Nurr-l、Girk2、 MAPT、SYT4、FOXAI、孤C、ASCLI、PINKI、PAX5、LMXIB、PITX3、NURR-1、LMXIA、ENI、PAX2、TFF3、 P口X2、DCX、MAP2、P口Xl或VMAT2 或其任何组合。
[0099] 可通过表达星形细胞标志物GFAP(胶质纤维酸性蛋白）、SlOO.目.等鉴定星形细 胞。
[0100] 可由主题诱导型NSC生成少突胶质细胞。可通过表达少突胶质细胞标志物GC(半 乳糖脑巧脂，也称为GalC);MBP(髓磯脂碱性蛋白）；CNP酶（2'，3'-环核巧酸3'-磯酸二醋 酶[或-磯酸水解酶]);或少突胶质细胞标志物神经内分泌特异性蛋白-4 (NSP4 ;也称为浆 膜蛋白-4 (reticulon-4)或RTM)、RIP(2'，3' -环核巧酸3' -磯酸二醋酶）、髓磯脂/少突 胶质细胞特异性蛋白（MOSP)、少突胶质细胞谱系转录因子2(01ig2)、少突胶质细胞标志物 01、NogoA或少突胶质细胞标志物04鉴定少突胶质细胞。
[0101] 本发明提供了由NSC分化DA神经元的高通量筛选测定。
[0102] 在另一实施方案中，本发明提供了一种生成多己胺能神经元的方法。所述方法包 括用检测点激酶1 (CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC)， 通过测定经处理hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞，用至少一种多己胺能神经元 诱导化合物处理NSC并且分析细胞的多己胺能神经元细胞标志物。在某些方面，CKl抑制 剂为SB218078 而BMP抑制剂为Dorsomoi^phiruLD-igSlSg或DMH-1。在一个优选方面，CKl 抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0103]一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0104] 在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 尸八8口7、尸0《42、尸(《04、6尸4口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、 S0X3或ST6GALNA巧或其任何组合。
[0105] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、k半脫亚 賴酸、犬尿唾晰酸、（时-(+)-HA-966、间氯苯基双脈盐酸盐、巧蛋白酶抑制剂、Dimaprit二 盐酸盐、8-轻基-DPAT-氨漠酸盐、反式-4-轻基己豆酸、盐酸法舒地尔、喔普醜胺、视黄酸、 AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215,OOl盐酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺脈隆、肯泡隆、化 218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺化巧、没药留丽、Ch55、3-MATIDA、SEW2871、 Immet虹idine二氨漠酸盐、LY364947、反苯环丙胺盐酸盐、（-)-野說碱或尼鲁米特或其任 何组合。在一个优选方面，多己胺能神经元诱导化合物为没药留丽。
[0106] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元细胞标志物可能为TUJUTH、化tJoxa2、 Nurr-I、Girk2、MAPT、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl、PINKl、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-I、LMX1A、 EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1 或VMAT2 或其任何组合。
[0107] 再一实施方案中，本发明提供多己胺能神经元。通过用检测点激酶I(CKl)抑制 剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂处理人多能干细胞化PSC)，通过测定经处理hPSC的神 经干细胞标志物鉴定神经干细胞，用至少一种多己胺能神经元诱导化合物处理NSC并且 分析细胞的多己胺能神经元细胞标志物生成主题DA神经元。在某些方面，CKl抑制剂为 SB218078 而BMP抑制剂为Dorsomoi^phiruLD-igSlSg或DMH-1。在一个优选方面，CKl抑制 剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。
[0108]一方面，hPSC为人胚胎干细胞化ESC)、人孤雌生殖干细胞化pSC)或诱导型多能干 细胞（iPSC)或由其衍生的细胞系。
[0109] 在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 尸八8口7、尸0《42、尸(《04、6尸4口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、 S0X3或ST6GALNA巧或其任何组合。
[0110] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、k半脫亚 賴酸、犬尿唾晰酸、（R)-(+)-HA-966、间氯苯基双脈盐酸盐、巧蛋白酶抑制剂、Dimaprit二 盐酸盐、8-轻基-DPAT-氨漠酸盐、反式-4-轻基己豆酸、盐酸法舒地尔、喔普醜胺、视黄酸、 AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215,OOl盐酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺脈隆、肯泡隆、化 218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺化巧、没药留丽、Ch55、3-MATIDA、SEW2871、 Immet虹idine二氨漠酸盐、LY364947、反苯环丙胺盐酸盐、（-)-野說碱或尼鲁米特或其任 何组合。在一个优选方面，多己胺能神经元诱导化合物为没药留丽。
[0111] 在所述方法的另一方面，多己胺能神经元细胞标志物可能为TUJUTH、化tJoxa2、 Nurr-I、Girk2、MAPT、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl、PINKl、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-I、LMX1A、 EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITXl或VMAT2 或其任何组合。
[0112] 如实施例中所示，公开的方法导致全功能性多己胺能神经元生成。DA神经元显示 出神经突生长和多己胺释放（图6A)。没药留丽佑巧经鉴定为多己胺能分化的最佳诱导剂 之一（图6A)。经GS处理的细胞显示出神经突延伸并且表达TUJl、TH、Dat、化xa2、Nurr-l 和Girk2(图她）、MAPT、F0XA2、SYT4、F0XA1JDC、AS&1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR1、 LMX1A、EN1、GI服2、孤C和VMAT2(图她、抓和6E)。此外，FACS分析显示超过97%的口控细 胞为TH阳性（图6C)。SYT4(突触结合蛋白4)在突触可塑性和多己胺释放中起重要作用。ASCLl在腹侧中脑表达并且表明衍生细胞具有适当表现型。全细胞膜片谢电生理学（图6G、 图細和图61)显示，DA神经元在电压谢模式中显示出内向化+电流（图6H)，并且在电流 谢模式中注入电流时显示出放电动作电位（图61)。该证明使用公开方法由hPSC生成了全 功能性多己胺能神经元。
[0113] NSC可能在神经疾病和病症的治疗中起重要作用。神经变性是神经元结构或功能 逐渐丧失，包括神经元死亡的涵盖性术语。由于神经变性过程发生许多神经变性疾病，包括 帕金森氏症、阿尔茨海默病（Alzheimer'S)和亨廷顿氏病化untington'S)并且特征在于 进行性神经系统功能障碍。神经疾病和病症包括但不限于阿尔茨海默病和其它痴呆、脑癌、 神经退行性疾病、脑炎、癒痛、遗传性大脑奈乱、头和脑部崎形、脑积水、中风、帕金森氏症、 多发性硬化、肌萎缩侧索硬化（ALS或路格里克氏病（LouGehrig'sDisease))、亨廷顿氏 病、化病毒病、中风等。
[0114] 已经证实神经干细胞参与了垂死神经元的迁移和替换。另外，已经阐明了小鼠中 风期间海马干细胞的作用。该些结果证明由于损伤，NSC可加入成人脑部。此外，已经证明 NSCW定向方式迁移到脑部肿瘤中。进一步地，已经研究了NSC对损伤反应的分子机制。损 伤期间释放的趋化因子，例如SDF-Ia,负责人和小鼠NSC向小鼠损伤区域的定向迁移。寻找 另外在损伤环境下起作用的机制和在急慢性疾病期间它们如何影响NSC的反应是研究热 点。
[0115] 另一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病和病症的方法。所述方法包括向有 神经疾病或病症的受试者施用NSC。
[0116] 再一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病和病症的方法。所述方法包括向有 神经疾病或病症的受试者施用NSC或DA神经元。
[0117] 另一实施方案中，本发明提供了用于生成NSC的试剂盒。所述试剂盒可包括检测 点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂、鉴定神经干细胞标志物的试剂和由 hPSC生成NSC的说明书。一方面，CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DorsomoiDhin、 LD-193189或DMH-I。在某些方面，CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomo^hin; CKl抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189 ;CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂 为DMH-1。所述试剂盒可包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、 6尸八口、11?14、]\111333111-1、祖口2、巢蛋白、(^《2、口4《6、1'册83、5(?1、5(?2、5(?3或5166411^(：5 神经干细胞标志物的试剂。
[0118] 另一实施方案中，本发明提供了用于生成多己胺能神经元的试剂盒。所述试剂盒 包括检测点激酶I(CKl)抑制剂和骨形态发生蛋白炬M巧抑制剂、鉴定神经干细胞标志物的 试剂、至少一种多己胺能神经元诱导化合物、鉴定多己胺能神经元细胞标志物的试剂和由 hPSC生成多己胺能神经元的说明书。一方面，CKl抑制剂为SB218078，BMP抑制剂为DMH-I 并且多己胺能神经元诱导化合物为没药留丽。所述试剂盒可包括鉴定BRN2、CD113、CD15、 CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-I、MAP2、巢蛋白、0TX2、PAX6、TUBB3、 SOX1、S0X2、S0X3或ST6GALNA巧神经干细胞标志物的试剂。所述试剂盒还可包括鉴定TUJl、 TH、Dat、化xa2、Nurr-UGirk2、MAPT、SYT4、F0XA1、孤C、AS化1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、 NURR-I、LMX1A、ENl、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITXl或VMAT2 多己胺能神经元细胞标 志物的试剂。
[0119] 下列实施例旨在说明，而非限制本发明。
[0120] 实施例1
[0121] hPSC的牛长
[0122] 使用高通量筛选策略鉴定了两种有效的神经诱导剂，SB218078和DMH-I(图5A)。 SB218078是Stauprimide的结构同系物，已经证实其使胚胎干细胞对分化初免，并且DMH-I 是dorsomcxrphin的同系物，其有效诱导hPSC中的神经转换。为衍生NSC，通过将基质胶上 生长的hPSC从StemPro转移到补充了 5yMSB218078和1yMDMH-I的N2B27培养基中诱 导初生神经上皮。在该些神经诱导剂的存在下6天后，Pax6, 一种神经诱导的早期标志物明 显上调（图3和5B)。第7天，将中和hPSC转移到NSC培养基中，然后分离W衍生增生NSC。 4次传代后，hPSC衍生的NSCQiPSC-NSC)群体98%对巢蛋白呈阳性，96%对Musashi-I呈 阳性，95%对PAX6呈阳性，0%对0CT4呈阳性（图5C和图抓）。基因表达微阵列分析显示 假定的NSC标志物，包括FABP7、BRN2、S0X3、ST6GALNAC5、CXCR4、DCX、肥S和MSI上调（图 祀）。FABP7编码CNS发育所牵涉的脑脂肪酸结合蛋白并且在NSC中高度表达。ST6GALNA巧 编码介导细胞通过血脑屏障的通道的a2, 6-唾液酸转移酶。实时PCR(RT-PCR)数据进一 步确认了NSC标志物的上调，并且最重要的是，显示多能性标志物0CT-4和NANOG完全下调 (图5F)，得出的结论是已经获得了神经干细胞的高度富集群体。该些NSC适于进一步扩增、 冷藏和分化，使其成为DA神经元的实用来源。
[0123] 具体地，首先将hPSC系[人胚胎干细胞系WA-09和人孤雌生殖干细胞系化C2P 和化C12PH(国际干细胞公司）]维持在胚胎干细胞培养基的丝裂霉素-C灭活小鼠胚胎 成纤维细胞（Millipore)饲养层上；敲除DMEM/F12(LifeTechnologies)、2mM1^-谷氨醜 胺（GlutaMax-I,Invihogen)、0.ImMMEM非必需氨基酸（LifeTechnology)、0.ImM目-琉 基己醇（LifeTechnologies)、青霉素 / 链霉素 / 两性霉素B(100U/100Ug/250ng) (MPBiomedicals)和 5ng/mlbFGF(Peprotech)。每 5-7 天按 1:4 或 1:6 的分流比， 用分散酶（dispase)(LifeTechnologies)使细胞传代。然后将hPSC转移到基质胶 炬DBiosciences)涂层板上并用StemProhESCSFM培养基（Invitrogen)生长；具有 GlutaMAXUXSTEMPROhESCSFM生长补充物、1.8%牛血清白蛋白、8ng/mLbFGF和 0.ImM 2-琉基己醇的DMEM/F12。
[0124] 实施例2
[0125] hPSC的无伺养房牛长
[0126] 然后将hPSC系UX12PH转移到基质胶炬DBiosciences)涂层板上并用StemPro hESCSFM培养基（Invitrogen)生长：具有GlutaMAXUXSTEMPROhESCSFM生长补充物、 1.8%牛血清白蛋白、8ng/mLbFGF和0.ImM2-琉基己醇的DMEM/F12。
[0127] 实施例3 阳12引 高通量神绕诱导hPSC筛洗测定
[0129]通过用于N2B27 培养基[敲除DMEM/F12、1XGlutaMax、lXN2/B27 补充物 (Invitrogen)]中由SB218078巧uM)加上DMH-I(IyM)组成的化学组合处理在无饲养层 培养条件下生长的未分化WS口天，衍生hPSC-NSC。然后用Ac州tase(Sigma)分离中和 hPSC并且在基质胶涂层板上于NSC培养基中[敲除DMEM/F12、2%StemPro神经补充物、IX GlutaMAX、20ng/mlbFGF和20ng/mlEG円生长>4代W生成并高纯度且同源的hPSC-NSC群体。
[0130]实施例4 阳1引]高通量《R胺神绕元细胸分化筛洗测定
[0132] 为获得DA神经元，首先用lOOng/mLFGF8和2yM嘿吗啡胺（Purmo巧hamine)经 7天将hPSC-NSC初免为DA前体，然后用于筛选诱导终末多己胺能分化的小分子（图6A)。 按96孔板2000个细胞/孔接种DA前体并且按2. 5yM用小分子库（Tocris1120生物活 性化合物）处理2周（图6A)。通过神经突生长测定多己胺能分化并且通过化ISA分析测 定多己胺释放（图6A)。从该种筛选，在多己胺能分化最佳诱导剂中鉴定了天然存在的类 固醇，没药留丽佑巧（图6A)。分化30天后，经GS处理的神经元看起来精细的神经突延伸 成熟。在该个阶段，衍生化细胞不但表达主要神经元标志物目-III-微管蛋白（TUJ1)，而 且表达重要的DA神经元标志物酷氨酸轻化酶（TH)、多己胺转运体值at)Joxa2、Nurr-l和 Girk2(图她）。此外，FACS分析显示97%W上的口控细胞为TH阳性（图6C)。基因表达微 阵列分析指出多己胺能和神经元相关标志物例如MAPT、F0XA2、SYT4、FOXAl、孤C、ASCLl和 PINKl上调（图抓）。SYT4(突触结合蛋白4)在突触可塑性和多己胺释放中起重要作用。 ASCLl在腹侧中脑表达并且表明衍生细胞具有适当表现型。对来自黑质的hPSC、NSC、DA神 经元和组织的基因表达的进一步分析显示hPSC衍生的DA神经元已获得具有经历朝向SN 中存在的细胞的神经分化特有的基因表达特征的元件，并且它们在NSC之后和SN期之前发 育定位。RT-PCR用标志物例如？4《5、11?18、？口《3、抓1^1、11?14、6化、61服2、孤(：和￥臟12 的特征表达进一步确认了DA神经元一致性（图6E)。最重要的是，与对照细胞（用FGW和 嘿吗啡胺处理1周并用0. 1 %DMSO代替GS处理2周的NSC)相比，通过化ISA测定，经GS 处理的细胞展现出多己胺分泌增加5倍（图6F)。全细胞膜片谢电生理学（图6G、图細和 图61)显示，在GS处理90天后，DA神经元在电压谢模式中显示出内向化+电流（图6H)， 并且在电流谢模式中注入电流时显示出放电动作电位（图61)。使用微电极阵列（MEA)系 统在经GS处理的神经元的完全培养物中记录到自发性动作电位（图6J)。MEA培养皿中总 共64个电极的约H分之一显示出中等活性（乂个峰/min)。该些神经元的特征在于两个基 本放电表现型；周期性波峰爆发放电的表现型和定期单峰放电的表现型（图6J和6K)。
[0133] 所述方法具体牵涉在NB培养基[NeuroBasal培养基、IXGlutaMAX、 IXN2/B27 补充物（Invitrogen)]中用嘿吗啡胺（2^M)和FGF8(100ng/mL)将 hESC-册-NSC(Invitrogen)和hPSC-NSC处理7天。在嘿吗啡胺和FGF8处理7天后，用 Ac州tase(Sigma)分离NSC并且按20, 000个细胞/mL接种到基质胶涂层96孔板上并按 2. 5yM最终浓度用小分子库（Torcris1120生物活性化合物）处理两周（图6A)。用小分 子处理两周后，在视觉上观察所有孔并基于神经突密度评分。用小分子处理两周后，在视觉 上观察所有孔并基于神经突密和多己胺释放评分。为测量神经突密度，用4%多聚甲酵固定 细胞并且使用Cellavista细胞成像系统（RocheAppliedScience)从随机选取的视野获 得相衬图像。使用Cellavista密度软件图像处理程序测量神经突密度。每种实验条件在 两个孔中进行，并且进行至少3次独立实验W获得最终结果。
[0134] 收集来自上部神经突诱导剂（表1)的条件培养基（与0. 1 %DMSO处理的对照相 比，含有高密度神经突的孔）并且使用多己胺化ISA测定（CosmoBio)分析。从每孔含有 50,OOO个细胞的样品收集条件培养基并且在3000RPM下离也W去除细胞碎片。然后收集上 清液并分析，W使用商业多己胺化ISA测定试剂盒（化saCosmoBio)进行多己胺的定量测 定。使用微量滴定板酶标仪炬IO-TEKSynergy2)进行数据分析。呈现的结果来自于H个 独立实验（n= 3)并且表示为平均数+平均数标准误差（S.e.m.)并且使用双尾学生t检 验进行统计分析，置信水平为95%(a=0.05)，统计显著性为P<0. 05。另外，收集来自每 个孔的总RNA并通过RT-PCR分析来自hPSC-NSC的MAP2、TH、G服2、EN1、DAT、AADC、 PAX2、NURR1、PITX3和LMXlB的表达（表2)。RT-PCR数据分析表明，处理两周后，所有最佳 命中表达与成熟多己胺神经元相关的基因。ELISA数据分析表明上部小分子神经突诱导剂 生成比对照非处理细胞更高水平的多己胺（1.5ng/mL)。没药留丽处理的hPSC-NSC诱导最 高水平的多己胺自发性释放（图5A)。通过用肯泡隆（33%)、没药留丽（35%)、犬尿唾晰 酸（19% )、Immet虹idine二氨漠酸盐（21% )和Dimaprit二盐酸盐（18% )化学处理产生 的TH阳性细胞的百分比高于从使用标准多己胺能分化培养基炬DNF20ng/mL、GDNF2化g/ 血、CAMP200yM、抗坏血酸200yM、TGF目3 2ng/mL和DAPT)分化> 1个月的hPSC-NSC获得 的TH阳性细胞的15%。
[01巧]全细胞膜片谢电生理学法。对于电生理记录，将细胞转移到固定在倒置Olympus显微镜上的记录槽中。记录期间，将温度维持在31-32°C，并且在抑7. 30和315m0sm下按 Iml/min.恒定流量，用150mM化Cl、4mM KCl、1.8mM CaClaUmM MgCl2、10mM肥阳S、10mM葡 萄糖灌注细胞。在抑7. 30和290m0sm下使用尖端电阻为2-3MQ，填充了130mM K-葡糖酸、 SmM化Cl、5mM KCLlOmM肥阳S、20mM藏糖、0.3mM EGTA、3mM MgATP的测娃酸盐电极获得全 细胞记录。使用肥KA EPC-IO数字转换器/放大器获得数据。一旦实现全细胞进入，就立 即记录静止膜电位；然后使细胞平衡3-5min。然后从-70mV的静止膜电位，在电流谢模式 下经200ms电流注入使细胞去极化，在0. 2Hz.下输送，并且幅度从50pA增加到高达IOOOpA W诱导动作电位。通过施加电压斜升测定内向或外向电流的存在。将记录配置不稳定或串 联电阻变得大于15MQ的细胞从研究中排除。记录了二十个不同的细胞并且从7个膜片谢 细胞获得动作电位。
[0136] 微阵列分析方法。根据生产商的方案从重复样品团粒（RNeasy;Qiagen)提取并收 集总RNA。进一步加工之前对每个样品确定RNA量（QubitRNABR测定试剂盒；Invitrogen) 和质量（RNA6000Nano试剂盒；Agilent)为最佳。使用IlluminaTotalPr巧RNA扩增试 剂盒根据生产商的方案扩增每份样品2(K)ngRNA并且如W上量化。使每份样品750ng生物 素化RNA与IlluminaHT-12V4表达微珠芯片杂交，用IlluminaiScan微珠阵列扫描仪扫 描并且在GenomeStudio和Iumi生物导体包中控制质量。所有RNA加工和微阵列杂交均根 据生产商的方案进行。在GenomeStudio中，过滤在至少一份样品中检测出P值为0.Ol的 探针并且输出用于在R中标准化。转化原始探针表达值并且使用IumiR/生物导体包中 执行的鲁棒样条标准化法（robustsplinenormalization) (RSN)标准化。为获得维恩图 (VennDiagram),使用QlucoreOmniExplorer。使用双尾学生t检验鉴定在成对细胞类型 之间差异性表达的转录产物OiPSC与黑质、hPSC与NSC和hPSC与多己胺能神经元），P值 截断值<0.05而方差截断值>0.005。然后将差异性表达探针组相互比较。基因表达阵列数 据在NCBIGEO数据库中，在存取指定号GSE42265下可用。
[0137] 统计分析。结果表示为平均数+平均数标准误差（S.e.m.)并且使用95%置信水 平（a= 0. 05)进行统计分析，用双尾学生t检验比较两个组或用Dunnett检验的单因素ANOVA将多个组与对照比较。对于所有试验而言统计显著性的标准为P<0. 05。
[013引另外的方法阳13引 RT-PCR分析
[0140]使用QIAsymphony自动纯化系统或RNeasyPlusMini试剂盒，根据生产商的说明 (Qiagen)分离来自各具约1百万个细胞的至少H份样品的总RNA。总RNA用于用iScript cDNA合成试剂盒炬iorad)和Px2热循环仪（ThermoScientific)反转录。为分析基因表 达，每次反应使用1/25的cDNA和如antiTect引物测定与如antitestSYBR绿色混合液 (Qiagen)进行PCR反应，一式两份。在 95°C下使用Rotor-GeneQ(Qiagen)进行qPCR, 5min, 在92°C下进行5s并且在6(TC下进行20s，循环37次，接着融解W检查从50到99°C，每个 步骤升高rC，扩增子的特异性。对标准曲线进行相对定量并且对通过PPIG测定的输入标 准化量化值。在补充表Sl中列出了用于分析的引物。结果表示为平均数+s.e.m.并且使 用95%的置信水平（a=0. 05)进行统计分析，用双尾学生t检验比较两个组或用Dunnett 检验的单因素ANOVA将多个组与对照比较并且将P<0. 05视为显著。 阳1川免疫细胸化学
[0142]在室温下将每份样品大约100, 000个细胞用4%多聚甲酵固定lOmin，用PBS洗 涂，并且在室温下在于PBS中的0. 3%TritonX-100、5%常规驴血清和1%BSA中透性化和 封闭1小时。在4°C下在于PBS中的0. 3%TritonX-100、2%BSA中用一级抗体赔育细胞 整夜。用PBS洗涂细胞H次并且在室温下在于PBS中的0.3%TritonX-100、5%常规驴血 清和1%BSA中用二级抗体赔育1小时。用DAPI为细胞核染色。在补充表S2中列出使用 的所有抗体。显示来自至少H次独立实验的代表性图像。 阳14引流式细胸术
[0144] 对于流式细胞术分析，用Accutase收获每份样品1百万个细胞，用PBS洗涂并且 在室温下用4%多聚甲酵固定30min。用PBS洗涂细胞两次并且在室温下用于PBS中的 0.3%TritonX-100、5%常规驴血清和1%BSA封闭1小时。然后在4°C下在于PBS中的 0. 3%TritonX-100、5%常规驴血清和1%BSA中用一级抗体赔育细胞整夜。用PBS洗涂 细胞两次并且在室温下在于PBS中的.3%TritonX-100、5%常规驴血清和1%BSA中用二 级抗体赔育1小时。使样品在BectonDickinisonFACS化Iibur?4色流式细胞仪上运行并 且用CellQuestPro?软件（V6.0)分析数据。在补充表S2中列出使用的所有抗体。显示 来自H次独立实验的代表性结果。 。"引微由极降列（MEA)系统
[0146] 在分化第95天，在37°C下使用Muse微电极阵列（MEA)系统（AxionBiosystems) 在补充了 2. 5yM没药留丽的NB培养基[NeuroBasal培养基、IXGlutaMAXUXN2/B27补充 物（Invitrogen)]中进行来自培养的hPSC衍生DA神经元的细胞外电压记录。MEA培养皿表 面在由极间间距为200ym的纳米多孔笛构成的细胞外电极周围含有直径为30ym的8X8 个格栅（总共64个电极）。
[0147] 通过在无菌去离子水中冲洗3次，在70%己醇中冲洗1次和在100%己醇中冲洗 1次为MEA培养皿灭菌。然后为培养皿加盖并且倒置于加盖培养皿（petridish)中，并且 在5(TC下烘烤4-5小时。通过向每个培养皿添加500ml于测酸轴缓冲液（15mM袖8. 4)中 的过滤化22ym过滤器）0. 1%阳I并且在室温下赔育I小时沉积聚己帰亚胺（PEI)基底 涂层。吸入阳I溶液后立即用Iml去离子水洗涂培养皿4X，并且在组织培养罩内风干整 夜。直接在电极栅上添加75y1的1:30稀释于敲除DMEM/F12中的无菌基质胶溶液，并且在 37C下在组织培养箱中赔育1小时。然后去除基质胶溶液并且将50y1于含有约100, 000 个细胞的NB培养基中的2. 5yM没药留丽涂到MEA表面并且在37C下赔育30minW使细胞 附着。先前已经在于NB培养基中的2. 5yM没药留丽中，在基质胶上培养了DA神经元65 天并且通过机械研磨从板上移除。赔育30min后，向MEA孔内添加550y1的NB培养基并 且在37C下赔育24小时。更换培养基，此后每3-4天更换一次。
[0148] 同时在所有电极上，在12. 5曲Z下W200-5000化硬件滤波器带宽对电压数据取 样，并且保存到具有Axis软件（AxionBiosystems)的计算机上。为了在神经元峰值检测 之前去除高频电噪声，在软件中用200-2500化单阶Butterworth带通滤波器处理原始信 号。用设为基线电噪声标准偏差的±5倍的检测阔值鉴定动作电位峰值。该阔值通常等于 7. 5-11. 25yV。用Axis制作彩色编码峰值率图。对于峰值光栅图和峰峰间隔直方图而言， 向Neuroexplorer(肥XTechnologies)输出受检峰值的时间标记。进行两次独立记录。
[0149]表1
[0150]
【权利要求】
1. 一种生成神经干细胞（NSC)的方法，包括： (a) 用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂处理人多能干细胞 (hPSC);和 (b) 分析所述细胞的神经干细胞标志物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组： Dorsomorphin、LD-193189 和DMH-1。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 Dorsomorphin。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 LD-193189。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂为 DMH-1。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述神经干细胞标志物选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、0TX2、PAX6、TUBB3、S0X1、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 或其任何组合。
8. -种神经干细胞，其通过根据权利要求1所述的方法衍生。
9. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078。
10. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述BMP抑制剂选自由以下组成的组： Dorsomorphin、LD-193189 和DMH-1。
11. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为Dorsomorphin。
12. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为LD-193189。
13. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP 抑制剂为DMH-1。
14. 根据权利要求8所述的神经干细胞，其中所述细胞表达选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、(7^2、？4乂6、!'皿83、5(?1、5(?2、5(?3和5了6641隱05或其任何组合的神经干细胞标志物。
15. -种由人多能干细胞生成多巴胺能神经元的方法，包括： (a) 用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂处理人多能干细胞 (hPSC)； (b) 通过鉴定神经干细胞标志物鉴定神经干细胞； (c) 用至少一种多巴胺能神经元诱导化合物处理NSC;和 (d) 分析细胞的多巴胺能神经元细胞标志物。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078并且所述BMP抑制 剂选自由以下组成的组：Dorsomorphin、LD-193189和DMH-1。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述BMP抑制剂 为DMH-1。
18. 根据权利要求15所述的方法，其中所述神经干细胞标志物选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、0TX2、PAX6、TUBB3、S0X1、S0X2、S0X3 和ST6GALNAC5 或其任何组合。
19. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多巴胺能神经元诱导化合物选自由以下组 成的组：高奎宁酸、L-半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、（R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙 蛋白酶抑制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴豆酸、盐酸 法舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215, 001盐酸盐、盐酸咪洛 克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆、CL218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺吡啶、没药甾酮、 Ch55、3-MATIDA、SEW2871、Immethridine二氢溴酸盐、LY364947、反苯环丙胺盐酸盐、 (_)-野靛碱和尼鲁米特或其任何组合。
20. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多巴胺能神经元诱导化合物为没药甾酮。
21. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多巴胺能神经元细胞标志物选自由以下组 成的组：TUJl、TH、Dat、Foxa2、Nurr-l、Girk2、MAPT、SYT4、F0XAl、DDC、ASCLl、PINKl、PAX5、 LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1 和VMAT2。
22. -种多巴胺能神经元，其通过根据权利要求15所述的方法生成。
23. 根据权利要求22所述的多巴胺能神经元，其中所述CK1抑制剂为SB218078而所述 BMP抑制剂为DMH-1。
24. 根据权利要求22所述的多巴胺能神经元，其中所述NSC表达选自由以下组成的组： BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、F0XA2、F0X04、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、(7^2、？4乂6、!'皿83、5(?1、5(?2、5(?3和5了6641隱05或其任何组合的神经干细胞标志物。
25. 根据权利要求22所述的多巴胺能神经元，其中所述多巴胺能神经元诱导化合物选 自由以下组成的组：高奎宁酸、L-半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、（R)-(+)-HA-966、间氯苯基双 胍盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴 豆酸、盐酸法舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI215, 001盐酸盐、 盐酸咪洛克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆、CL218872、CV1808、Ro15-4513、二盐酸利诺吡啶、没 药甾酮、Ch55、3-MATIDA、SEW2871、Immethridine二氢溴酸盐、LY364947、反苯环丙胺盐 酸盐、（-)_野靛碱和尼鲁米特。
26. 根据权利要求25所述的多巴胺能神经元，其中所述多巴胺能神经元诱导化合物为 没药甾酮。
27. 根据权利要求22所述的多巴胺能神经元，其中所述多巴胺能神经元细胞标志物选 自由以下组成的组：TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、F0XA1、DDC、ASCL1、 PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1 和 VMAT2。
28. -种用于生成NSC的试剂盒，包括： (a) 检测点激酶抑制剂（CK1)和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂； (b) 测定神经干细胞标志物的试剂；和 (c) 由hPSC衍生NSC的说明书。
29. -种用于生成多巴胺能神经元的试剂盒，包括： (a)检测点激酶抑制剂（CK1)和骨形态发生蛋白（BMP)抑制剂； (b) 测定神经干细胞标志物的试剂； (c) 至少一种多巴胺能神经元诱导化合物； (d) 测定多巴胺能神经元干细胞标志物的试剂；和 (e) 由hPSC生成多巴胺能神经元的说明书。
【文档编号】C12N5/0797GK104379732SQ201380024659
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2012年4月24日
【发明者】R·冈萨雷斯, I·加里陶南迪亚, R·斯莫切肯 申请人:国际干细胞公司