利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物工程技术，具体地说是一种利用基因重组病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法：重组慢病毒载体构建；神经干细胞的分离、培养及鉴定；重组病毒转染NSCs；重组慢病毒转染NSCs的鉴定；重组病毒转染NSCs：取传代3次后的NSCs消化制备成单细胞悬液，接种至培养板中；转染TH+Brn4基因重组慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；同时用嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；本发明的优点在于：通过构建目的基因TH和Brn4的慢病毒载体，转染NSCs后外源性基因能在细胞内稳定表达；分化后产生高比例的TH阳性多巴胺能神经元；Brn4能促进神经营养因子的高表达，且具有抑制细胞凋亡的功能。
【专利说明】利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的
方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。【背景技术】
[0002]帕金森病(Parkinson’ s Disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其基本病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死，数量减少，致使纹状体内多巴胺神经递质释放减少，从而产生震颤、肌肉强直等一系列运动障碍症状。
[0003]传统的药物治疗和外科治疗仅限于改善症状，但并不能阻止病情发展，不能从根本上解决问题。由于此病变主要侵犯中脑黑质多巴胺能神经元，且黑质多巴胺能神经元投射的靶区纹状体定位明确，所以在黑质-纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的细胞，恢复多巴胺的神经环路是一个针对病因治疗的理想方法。
[0004]近三十年来，ro的脑内移植研究取得了较大的进展，有许多ro患者接受了流产胎儿中脑组织的移植，移植组织中的多巴胺神经元能够长期存活，并不断释放多巴胺，使病人的运动症状得以明显改善。这表明细胞移植替代治疗是治疗ro较有希望的方法。但因胚脑移植物来源有限、异体免疫排斥及伦理等问题，胚脑组织移植在实际应用中受到很大限制。
[0005]神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是当前国际上研究的热点之一,它不仅存在于胚胎脑组织中，在成年脑内也已被发现。NSCs不仅具有分裂增殖和自我更新的能力，还具有多分化潜能，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经系统多种类型的细胞，包括多巴胺能神经元。因此，NSCs作为细胞移植替代治疗的供体细胞治疗ro等神经系统退行性疾病具有巨大的潜力和优越性。然而，研究表明体外培养的NSCs —般情况下大多分化为胶质细胞，很少分化为神经元，特别是特异性的多巴胺能神经元，这给临床应用NSCs移植治疗ro造成了极大的障碍。同时，目前的研究表明单独NSCs移植后细胞存活率只有5% -10%，且不能有效地迁移分化并整合到宿主的神经环路中，从而不能很好的释放神经递质发挥生理功能。
[0006]所以探讨诱导NSCs分化为多巴胺神经元的方法以及促进移植的细胞在体内存活，较长时间地分泌多巴胺是NSCs移植治疗ro研究中迫切需要解决的问题。
[0007]酪氨酸轻化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)是细胞内酪氨酸合成多巴胺过程中的限速酶，通常作为多 巴胺能神经元的特异性标志，其表达情况是NSCs能否转化为多巴胺能神经元的关键。研究发现，脑内TH含量与中脑多巴胺含量呈线性正相关，H)患者脑内TH及TH mRNA的水平明显低于正常人，提示补充脑内TH基因可促进多巴胺的生物合成。将人或鼠TH基因作为目的基因转入多种细胞的体内和体外实验证明，经TH遗传改造的细胞具有分泌多巴胺的能力。因此，设法提高NSCs的TH活性，促进多巴胺的生成和释放是NSCs移植联合转基因治疗H)的新方法。
[0008]Brn-4是转录因子POU蛋白家族第三类成员之一。许多资料表明，多种同源盒基因，如HOX、POU、UM、PAX等，编码的转录因子在胚胎发育过程中对神经细胞的分化、迁移和某些组织特异性基因的表达起着重要的调控作用。其中，POU同源盒基因在中枢神经系统发育过程中扮演着重要角色。根据POU区的全部氨基酸序列同源程度，哺乳动物POU蛋白分为Class I~ClassVI共六类，Brn_4和Brn-l、Brn-2、Tst_l同属于第III类，在胚胎早期Brn-1、Brn-2、Brn-4即在神经系统中出现，且分布广泛，提示这些因子可能参与早期神经发生。近期在《Nature》上的一篇报道中，将三个转录因子Ascll、fcn-2、Mytll导入来自成年大鼠尾部的皮肤细胞，一周后，约有20%的实验鼠皮肤细胞转化为神经细胞，这些神经细胞不但可以表达神经蛋白，而且可与其他神经细胞形成突触联系，表明POU蛋白家族成员Brn-2在神经发育中的关键作用。可见，POU蛋白家族的第III类因子对NSCs分化命运可能起着决定性的作用。Le Moine等的研究还发现，阻断成年哺乳动物黑质向纹状体的多巴胺能神经投射，会引起纹状体内Brn-4表达上调。表明Brn_4可能和成年哺乳动物去多巴胺能神经支配后纹状体内的神经再生与修复有关。
[0009]前期研究中，通过切割大鼠穹窿海马伞阻断自隔区向海马投射的胆碱能神经纤维建立去神经支配海马模型，将NSCs移植到海马内，植入的NSCs在去神经支配的海马内更容易存活，并且更多地分化为神经元，同时，存在于齿状回的内源性NSCs在去神经支配损伤刺激下也出现明显增生、迁移和神经元分化。上述结果表明，去神经支配损伤后，海马内局部微环境的改变为NSCs的存活、再生和向神经元分化提供了良好的条件。我们进一步利用原位杂交、RT-PCR、免疫组织化学和Western blot等多种方法检测发现，Brn_4的转录和表达水平在去神经支配的海马内均明显上调。在获得的去神经支配海马提取液中加入过量的Brn-4抗体中和其中的Brn_4，再与NSCs共培养，结果发现，抗体中和后，去神经支配海马提取液促进神经元分化的效应显著减弱。利用RNA干扰技术将针对Brn-4的小RNA片段转入NSCs中，下调细胞内Brn-4的水平，结果NSCs分化为神经元的比例明显下降。相反，过表达Brn-4的NSCs分化为神经元的比例明显升高，而且新生神经元的成熟度明显增加。这些结果说明Brn-4在NSCs向神经元分化成熟过程中起着十分重要的作用。进一步研究还发现，转染Brn-4基 因的NSCs在体外分化7天后,Western blot检测发现凋亡相关蛋白Caspase-3的表达明显低于对照组,提示Brn_4可能具有抑制细胞凋亡的作用。Shimazaki等的研究发现，在体外用脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胰岛素样生长因子-1 (Insulinlike growth factor-1, IGF-1)刺激来源于小鼠胚胎纹状体的NSCs分化过程中，Brn-4表达迅速上调，且Brn_4蛋白主要表达于新生的神经元内；应用反义寡核苷酸技术阻断Brn-4的功能，NSCs分化为成熟神经元的比例则下降。说明Brn-4可能通过一些神经营养因子的介导来调控NSCs向神经元的分化及其成熟。然而，Brn-4促进NSCs向成熟神经元分化并且维持移植细胞存活的分子机制在国内、外没有研究。如果能通过TH和Brn-4基因有效地诱导NSCs向成熟的多巴胺能神经元分化，并且通过Brn-4维持移植后细胞的存活，使之长时间地分泌多巴胺，纠正H)的病理和生化异常，改善临床症状，这将为多基因联合NSCs移植治疗H)提供新的方法和实验依据。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。[0011]为了实现本发明的目的，我们将采用如下技术方案予以实施:
[0012]利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，所述的方法包括如下实施步骤:
[0013]一、pLV5-TH+Brn4重组慢病毒载体构建:
[0014]根据pLV5-EFla-GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全长序列分别为ΝΜ_012740和ΝΜ_017252的基因，合成目的基因并构建pLV5_TH、pLV5-Brn4和pLV5_TH+Brn4慢病毒表达载体，包装滴度后进行测序鉴定和滴度鉴定；
[0015]二、神经干细胞的分离、培养及鉴定:
[0016]神经干细胞的培养方法:在无菌条件下取孕14d的SD胎鼠腹侧中脑组织，用吸管反复吹打直至为细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液，用基础培养基清洗3遍后重悬于NSCs培养液中，经细胞计数和活力观察后，按IX 105/ml细胞密度接种于含有IOml NSCs培养液的细胞培养瓶中，置于5%、37°C的C02培养箱中培养，3天后可见培养瓶内形成悬浮的NSCs球，7天后进行传代培养；
[0017]神经干细胞的分离方法:神经干细胞在培养瓶中培养3天后，用低速离心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶进行消化，约IOmin钟后用含10% FBS的基础培养液终止消化，通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液，进行细胞计数后培养瓶中继续培养;
[0018]神经干细胞的鉴定方法:取P3代NSCs在传代时培养液中加入终浓度为5 μ mol/L的BrdU进行标记,使BrdU整合到神经干细胞DNA中，7天后进行BrdU免疫突光检测；另取P3代以后的NSCs亚克隆球用Nestin免疫荧光检测证明其胚胎源性；将PlO代NSCs球接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培养液进行分化，2周后分 别进行MAP_2、GFAP和CNP免疫荧光检测以证明NSCs的多分化潜能；
[0019]重组慢病毒转染NSCs的鉴定，包括:
[0020]转染效率检测是将转染后的NSCs球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培养液，分化培养I周后终止培养，吸去培养液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在荧光显微镜下观察结果；
[0021]TUNEL法细胞凋亡检测是将各组NSCs分化培养2W后，吸去各孔中的培养液，用
0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用Roche公司TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测，最后PBS洗片3遍后，在避光条件下，加入Hoechst33342，室温湿盒孵育30min。PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置荧光显微镜下观察TUNEL、Hoechst阳性细胞核并摄片；用Statal0.0统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较；
[0022]高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量是将各组取NSCs分化培养液Iml，加入0.lmol/L过氯酸酸化培养液，14000rpm离心15min,取上清过滤后按吴燕琼等报道的方法行高效液相色谱测定；
[0023]其特征在于:该方法实施步骤还包括:
[0024]三、重组病毒转染NSCs :
[0025]所述的重组病毒的转染方法:取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液，细胞计数后接种至24孔培养板中，每孔接种4 X 104个细胞，加入500 μ I基础培养液悬浮细胞；细胞共分4组进行转染，每组6孔:Mock组转染pLV5-GFP慢病毒阴性对照；TH组转染pLV5_TH重组慢病毒；Brn4组转染pLV5_Brn4重组慢病毒；TH+Brn4组转染pLV5_TH+Brn4重组慢病毒；每孔加入20 μ 11 X 108TU/ml感染复数为50的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,轻轻摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；感染72小时后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，同时在培养基中加入I μ g/ml嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；7天后对各组形成的NSCs球进行传代培养；
[0026]四、重组慢病毒转染NSCs的鉴定。
[0027]利用所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法获得一种转染pLV5-TH+Brn4重组慢病毒的神经干细胞:是将所述的方法中所述的实施步骤三中获得的稳定转染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成单细胞悬液，用基础培养液将细胞配成2 X 106/ml，加入1.5ml细胞冻存管中，同时加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亚枫，混匀后密封，置4°C 1小时，-200C 2小时，然后直接放入_80°C超低温冰箱中保存获得。
[0028]所述的重组慢病毒转染NSCs的鉴定还包括=Western Blot检测、免疫荧光细胞化学检测:
[0029]所述的Western Blot检测是将各组转染后的NSCs球接种至24孔板中进行分化，另设一组未转染的NSCs作为对照组，分化培养2周后终止培养，按RIPA裂解液说明书的要求，提取各组中细胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直电泳对蛋白进行分离，Bio-Rad半干转印系统转膜15V,50min,5%脱脂奶粉封闭后分别加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗体、小鼠抗TH抗体、兔抗Brn4抗体、兔抗GDNF抗体、兔抗GFR α -1抗体、兔抗RET抗体，室温孵育2h，4°C过夜，次日分别加入辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室温孵育4h，然后进行曝光、显影并用所采集图像，用图像分析软件对Western blot结果进行平均光密度分析，并用统计的方法对各组数据进行方差分析和组间比较；
[0030]所述的免疫荧光细胞化学检测是各组NSCs分化2周后终止培养，对阴性对照组和各重组病毒转染组中细胞进行免疫荧光检测，简述如下:所用一抗分别为:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗为:结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育过夜,二抗室温下孵育2h，随后用Hoechst33342进行细胞核染色30min，中间各步骤之间均用0.01M PBS进行常规洗片，最后用20%甘油缓冲液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦显微镜下观察TH或DAT的表达情况，并计算GFP/TH和GFP/DAT双标细胞占Hoechst标记细胞的百分比，并用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较；
[0031]所述的高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量的色谱条件:色谱柱为4.6 X 250mm,颗粒度5 μ m的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱，柱温40°C，流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，流速为l.0ml/min，检测器为SH)-20A型紫外检测器，检测波长280nm ;定性分析:以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性；定量分析:先利用DA标准品绘制标准曲线，然后在相同条件下依次进行样品测定，用外标法定量，以峰面积表不含量。
[0032]所述的磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钾6.742g，磷酸氢二钾0.0114g，加水定溶至1000ml，用磷酸调节pH值至4.2，并用0.12 μ m纤维素脂膜过滤获得的。
[0033]所述的流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，其比例为97: 3。[0034]所述的NSCs 培养液由 DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF 组成。
[0035]所述的慢病毒的感染复数为50。
[0036]有益效果
[0037]—、我们从鼠胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力，并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；
[0038]二、成功构建带有目的基因TH和Brn4的慢病毒载体，转染NSCs后外源性基因能在细胞内稳定表达，得到大鼠NSCs-TH+Brn4细胞株；
[0039]NSCs-TH+Brn4在体外分化后能产生较高比例的TH阳性多巴胺能神经元，且这些神经元在形态、表型和功能上均较为成熟。Brn4能促进神经营养因子GDNF及其受体GFRa-1和Ret的高表达，同时还具有抑制细胞凋亡的功能，这些对于多巴胺神经元的分化、成熟以及维持其存活可能起到了重要的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为慢病毒载体的构建及慢病毒包装试验结果图；
[0041]图2为NSCs的培养、分离及鉴定结果图；
[0042]图3为重组病毒转染NSCs的效率检测结果图；
[0043]图4为Western blot检测结果图；
[0044]图5为免疫突光检测结果图；
[0045]图6为细胞凋亡检测结果图。
【具体实施方式】
[0046]结合附图，对本发明做进一步地说明:
[0047]第一部分体外实验
[0048]转染重组慢病毒的神经干细胞的制备和该神经干细胞的鉴定
[0049]实验材料
[0050]1.1、实验动物
[0051]孕14d Sprague-Dawley (SD)大鼠,清洁级，由南通大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK (苏)2002-0019。
[0052]1.2实验仪器
[0053](I) SF1D-2OA型紫外检测器(日本Shimadzu公司)；
[0054]⑵⑶2培养箱(法国Jouan公司)；
[0055](3)超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)；
[0056](4)低温冷冻离心机(德国Beckman公司)；
[0057](5) Leica DMR正置荧光显微镜(德国Leica公司)；
[0058](6) Leica DMIRB倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；
[0059](7)超低温冰箱(美国Nuaire公司)；
[0060](8) SDS-PAGE电泳槽及转膜装置(Bio-Rad公司)；
[0061](9) LeicaQwin 图像分析系统(Leica 公司)；[0062](IO)Molecular Imager ChemiDoc XRS System 米集图像(Bio-Rad 公司)；
[0063](Il)FVlOi智能型激光共聚焦显微镜(Olympus公司)；
[0064](12) TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司)；
[0065](13)细胞培养瓶(BD公司)；
[0066](14)200目尼龙网(BD公司)；
[0067](15)细胞冻存管(BD公司)；
[0068](16)纤维素脂膜(BD公司)；
[0069](17) Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱(Shimadzu公司);
[0070](18) Quantity One 图像分析软件(Bio-Rad 公司)。
[0071]1.3实验试剂
[0072]1.3.1慢病毒构建试剂
[0073](I) pLV5_EFla_GFP 慢病毒(Genepharma 公司)；
[0074](2)限制性核酸内切酶BamHI (MBI)；
[0075](3)限制性核酸内切酶NotI (MBI)；
·[0076](4) T4DNA Ligase (NEB 公司);
[0077](5) DNA纯化试剂盒(Axygen公司);
[0078](6) DH5 α 感受态细胞(TransGen Biotech 公司)；
[0079](7)氨节抗生素溶液(Invitrogen公司)；
[0080](8)包装质粒 Packaging Mix (Genepharma 公司)；
[0081](9)293FT 细胞(Invitrogen 公司)；
[0082](10) DMEM+10% FBS (Invitrogen 公司)；
[0083](11) Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)；
[0084](12) Opt1-ΜΕΜ 培养液(Invitrogen 公司)；
[0085](13)0.05% Trypsin(Invitrogen 公司)。
[0086]1.3.2细胞培养主要试剂
[0087](I)DMEM 培养基(Dulbecco’ s Modified EagleMedium,Cat.N0.12100-038，Gibco公司)；
[0088](2)F12 培养基(F12Nutrient Mixture, Cat.N0.21700-026，Gibco 公司)；
[0089](3)无血清培养添加剂 B27 (B27Supplement, Cat.N0.17504-044, Gibco 公司);
[0090](4)胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Cat.N0.16140-087, Gibco 公司)；
[0091](5)表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF, Cat.N0.E4127, Sigma 公司)；
[0092](6)喊性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-Basic, bFGF, Cat.N0.F0291, Sigma 公司);
[0093](7)细胞消化液 Accutase (Sigma 公司);
[0094](8) BrdU (5-Bromo-2-deoxyUridine，sigma 公司)；
[0095](9) RIPA 裂解液(碧云天，P0013B)；
[0096](10) 二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide, sigma 公司)。
[0097](11)嘌呤霉素(puromycm, sigma 公司)。
[0098]1.3.3主要抗体[0099](I)小鼠抗 TH(1: 200，Millipore 公司)；
[0100](2)大鼠抗 DAT(1: 5000，Millipore 公司)；
[0101](3)结合有 Alexa Fluor568 的山羊抗鼠 IgG(l: 500, Invitrogen 公司);
[0102](4)小鼠抗 β-actin 抗体(1: 2000, Sigma 公司)；
[0103](5)小鼠抗 TH 抗体(I: 200，Millipore 公司)；
[0104](6)兔抗 Bm4 抗体(1: 1000, Santa Cruz 公司);
[0105](7)兔抗 GDNF 抗体(I: 200，Abcam 公司)；
[0106](8)兔抗 GFRa-1 抗体(I: 5OO, Abcam 公司)；
[0107](9)兔抗 RET 抗体(I: 5000，Abcam 公司)；
[0108](10)辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG(l: 1000，Pierce公司)；
[0109](11)羊抗兔 IgG(l: 1000，Pierce 公司)；
[0110](12) Hoechst33342 (1: 2000，sigma 公司)。
[0111]1.4实验方法
[0112]一、重组慢病毒载体构建
[0113](I)目的基因获取
[0114]I)引物设计
[0115]根据Genepharma公司pLV5_EFla_GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH(NM_012740)和Bm4 (NM_017252)的cDNA功能全长序列设计合成PCR引物，上游引物5’端加BamHI位点序列，下游引物5’端加NotI位点序列，引物序列ΤΗ-1F、TH-1R、Brn4_lF、Brn4_lR、TH+Brn4、TH+Brn4 如序列表:
[0116]2)扩增目的基因片段并且胶回收
[0117](I) PCR 体系如下:
[0118]
【权利要求】
1.利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，所述的方法包括如下实施步骤: 一、pLV5-TH+Brn4重组慢病毒载体构建: 根据pLV5-EFla-GFP慢病毒表达载体的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全长序列分别为 NM_012740 和 NM_017252 的基因，构建 pLV5-TH、pLV5_Brn4 和 pLV5_TH+Brn4慢病毒表达载体，包装滴度后进行测序鉴定和滴度鉴定； 二、神经干细胞的分离、培养及鉴定: 神经干细胞的培养方法:在无菌条件下取孕14d的SD胎鼠腹侧中脑组织，用吸管反复吹打直至为细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液，用基础培养基清洗3遍后重悬于NSCs培养液中，经细胞计数和活力观察后，按I X 105/ml细胞密度接种于含有IOml NSCs培养液的细胞培养瓶中，置于5%、37°C的C02培养箱中培养，3天后可见培养瓶内形成悬浮的NSCs球，7天后进行传代培养； 神经干细胞的分离方法:神经干细胞在培养瓶中培养3天后，用低速离心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶进行消化，约IOmin钟后用含10% FBS的基础培养液终止消化，通过机械吹打的方式使其分散成单细胞悬液，进行细胞计数后培养瓶中继续培养； 神经干细胞的鉴定方法:取P3代NSCs在传代时培养液中加入终浓度为5 μ mol/L的BrdU进行标记，使BrdU整合到神经干细胞DNA中，7天后进行BrdU免疫荧光检测；另取P3代以后的NSCs亚克隆球用Nestin免疫荧光检测证明其胚胎源性；将PlO代NSCs球接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培养液进行分化，2周后分别进行MAP_2、GFAP和CNP免疫荧光检测以证明NSCs的多分化潜能； 四、重组慢病毒转染NSCs的鉴定，包括: 转染效率检测是将转染后的NSCs球接种至预涂有多聚赖氨酸圆盖片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培养液，分化培养I周后终止培养，吸去培养液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在荧光显微镜下观察结果； TUNEL法细胞凋亡检测是将各组NSCs分化培养2W后，吸去各孔中的培养液，用0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室温下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用TUNEL凋亡检测试剂盒按操作说明进行细胞凋亡检测，最后PBS洗片3遍后，在避光条件下，加入H0echst33342，室温湿盒孵育30min，PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置荧光显微镜下观察TUNEUHoechst阳性细胞核并摄片；用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较； 高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量是将各组取NSCs分化培养液1ml，加入`0.lmol/L过氯酸酸化培养液，14000rpm离心15min,取上清过滤后按吴燕琼等报道的方法行高效液相色谱测定； 其特征在于:该方法实施步骤还包括: 三、重组病毒转染NSCs: 所述的重组病毒的转染方法:取P3代NSCs消化制备成单细胞悬液，细胞计数后接种至24孔培养板中，每孔接种4 X IO4个细胞，加入500 μ I基础培养液悬浮细胞；细胞共分4组进行转染，每组6孔:Mock组转染pLV5-GFP慢病毒阴性对照；TH组转染pLV5_TH重组慢病毒；Brn4组转染pLV5_Brn4重组慢病毒；TH+Brn4组转染pLV5_TH+Brn4重组慢病毒；每孔加入20 μ IlX 108TU/ml的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,轻轻摇晃混匀后将培养板置培养箱中培养，12小时后更换新鲜分化培养基；感染72小时后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，同时在培养基中加入I μ g/ml嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定转染的细胞；7天后对各组形成的NSCs球进行传代培养。
2.利用权利要求1所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法获得一种转染PLV5-TH+Brn4重组慢病毒的神经干细胞，其特征在于:是将权利要求1中所述的实施步骤三中获得的稳定转染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成单细胞悬液，用基础培养液将细胞配成2X 106/ml，加入1.5ml细胞冻存管中，同时加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亚枫，混匀后密封，置4°C I小时，_20°C 2小时，然后直接放入_80°C超低温冰箱中保存获得。
3.根据权利要求1所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于:所述的重组慢病毒转染NSCs的鉴定还包括=Western Blot检测、免疫荧光细胞化学检测。 所述的Western Blot检测是将各组转染后的NSCs球接种至24孔板中进行分化，另设一组未转染的NSCs作为对照组，分化培养2周后终止培养，按RIPA裂解液说明书的要求，提取各组中细胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直电泳对蛋白进行分离，Bio-Rad半干转印系统转膜15V, 50min, 5%脱脂奶粉封闭后分别加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗体、小鼠抗TH抗体、兔抗Brn4抗体、兔抗⑶NF抗体、兔抗GFRa-1抗体、兔抗RET抗体，室温孵育2h，4°C过夜，次日分别加入辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室温孵育4h，然后进行曝光、显影并用所采集图像，用图像分析软件对Western blot结果进行平均光密度分析，并用统计的方法对各组数据进行方差分析和组间比较； 所述的免疫荧光细胞化学检测是各组NSCs分化2周后终止培养，对阴性对照组和各重组病毒转染组中细胞进行 免疫荧光检测，简述如下:所用一抗分别为:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗为:结合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育过夜，二抗室温下孵育2h，随后用Hoechst33342进行细胞核染色30min，中间各步骤之间均用0.01M PBS进行常规洗片，最后用20%甘油缓冲液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦显微镜下观察TH或DAT的表达情况，并计算GFP/TH和GFP/DAT双标细胞占Hoechst标记细胞的百分比，并用统计方法对各组数据进行方差分析和组间比较。
4.根据权利要求1所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于:所述的高效液相色谱法检测分化培养液中DA含量的色谱条件:色谱柱为4.6 X 250mm，颗粒度5μπι的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅胶柱，柱温40°C，流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，流速为l.0ml/min，检测器为SH)-20A型紫外检测器，检测波长280nm ;定性分析:以样品峰的保留时间与标准品保留时间对照定性；定量分析:先利用DA标准品绘制标准曲线，然后在相同条件下依次进行样品测定，用外标法定量，以峰面积表不含量。
5.根据权利要求4所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于:所述的流动相为磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液，其比例为97: 3。
6.根据权利要求1所述的 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于:所述的NSCs培养液由DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF组成。
7.根据权利要求1所述的利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的 方法，其特征在于:所述的慢`病毒的感染复数为50。
【文档编号】C12N5/10GK103865956SQ201310229277
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】谭雪锋 申请人:南通大学