养殖微藻的方法及生产油脂的方法

养殖微藻的方法及生产油脂的方法
【专利摘要】本发明涉及养殖微藻的方法及生产油脂的方法，其中的养殖方法包括：接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度大于30mmol/L，光自养培养＞10天收获。本发明的方法可用于大规模、低成本、高效率地养殖微藻，不但能保证微藻的快速生长，而且能使微藻有较高的油脂含量。
【专利说明】养殖微藻的方法及生产油脂的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及养殖微藻的方法及生产油脂的方法。

【背景技术】
[0002] 微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动 的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收C0 2，将光能转化为脂肪或淀粉等碳水化 合物的化学能，并放出〇2。利用微藻生产生物能源与化学品可以同时达到"替代化石能源、 减少co 2排放、净化废气与污水"三个目的。"微藻生物技术"的优势在于以下几个方面：① 微藻是光合效率最高的原始植物，与农作物相比，单位面积的产率高出数十倍。微藻也是自 然界中生长最为迅速的一种植物，通常在24h内，微藻所含生物质可以翻倍，在其"指数生 长期"内其生物量翻倍时间可以缩短到3. 5h。②微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中， 可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用 水进行培养，因此微藻可以不同农作物争地、争水。③产油率高，微藻干细胞的含油量可高 达70 %，微藻没有高等植物的根茎叶等细胞分化，在缺氮等条件下，某些单细胞微藻可大量 积累油脂，是最有前景的产油生物。④微藻的培养需要利用工业废气中的C0 2，缓解温室气 体的排放，也可以吸收工业废气中的氮〇x，减少环境的污染。⑤生产微藻生物柴油的同时， 还可以生产相当数量的微藻生物质，还可进一步获得蛋白质、多糖、脂肪酸等高价值产品。
[0003] 微藻可分为原核藻类和真核藻类，原核藻类以蓝藻为主，含叶绿素 a、不形成细 胞器、能进行光合作用，细胞中蛋白质含量高，可达干重的70%，脂肪含量低，为5%左右； 真核藻类种类比较多，是主要的生物燃料藻种的来源。常见的微藻主要归于以下八个门 类：娃藻门（Bacillariophyta)、绿藻门（Chlorophyta)、金藻门（Chrysophyta)、蓝藻门 (Cyanophyta)、甲藻门（Pyrroptata)、红藻门（Rhodophyta)、隐藻门（Cryptophyta)和黄藻 门（Xanthophyta)。其中，娃藻门、绿藻门和金藻门是最具潜力的生物柴油藻种来源。
[0004] 微藻高效规模化养殖技术，即通过研究开发微藻规模化养殖的新设备与新工艺来 高效、低成本地获得微藻生物量，是微藻生物技术的核心之一。影响微藻生长的因素很多， 主要有光、营养盐、C0 2、pH、温度和02等，这些因素在微藻规模培养过程中所产生的影响尤 为突出。研究表明，微藻的生长及脂类物质的含量与光照、氮、磷和温度等培养条件密切相 关。不同藻类生长和积累脂类物质的培养条件不尽相同，应该根据不同的藻种确定最佳培 养条件，提高生长速率和油脂含量。微藻的养殖需要有充足的阳光、C0 2、水和无机盐，温度 通常要控制在20?30°C，养殖介质必须能够提供组成微藻细胞的无机元素，如氮、P、K、Si、 Fe等。
[0005] 目前对于大部分微藻尤其是绿藻而言，提高其细胞油脂含量的主要培养方法是条 件胁迫，尤其是缺氮胁迫，即将藻细胞接种于缺氮环境的培养体系中以改变体内代谢的途 径，更多地合成脂肪而非蛋白质或糖类，从而达到提高脂肪含量的目的。然而限制氮源会影 响细胞的正常分裂和生长，使细胞活力下降，导致生物量急剧下降，最后总的脂肪产量并未 提升。现有的方法是，先在氮源充足的条件下快速积累微藻生物量，然后再将微藻从富氮的 培养基中分离出来再放入缺氮培养基中，进行条件胁迫以提高脂肪含量。这种方法不适合 大规模工业生产，因为将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中过程繁琐且 能耗极1?。
[0006] 如何高效率、低成本地采收微藻一直是微藻生物技术中的难题，主要原因是：微藻 个体微小(通常小于20微米）且藻液浓度很低(在采收浓度下，通常不到藻液质量的3%。）。 现有的微藻采收方法主要是絮凝法、过滤法、离心法和沉降法。其中，絮凝法、过滤法和离心 法的工艺较复杂、成本较高。沉降法具有操作简便、节省能源等优点，如CN101748068公开 了一种微藻收获方法，该方法利用重力学原理，针对高密度连续培养光合生物反应系统进 行不完全收获，对于浓度大于1〇 7个每毫升的藻液(相当于〇D_=l. 0)，沉降率一般可达60% 以上，沉降后分离出的上层清液返回光反应系统继续利用，对于不容易沉降的微藻，如小球 藻，需要使用pH调节剂将藻液pH调节至强碱性，使微藻产生自絮凝以加快沉降。该方法仍 存在以下不足：①调节pH强碱性使其自絮凝，会导致成本的增加并影响微藻的活力，不利 于循环利用藻种；②某些情况下，轻微的扰动就会使微藻重新分散，不利于分离沉降后的清 液。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的之一是提供一种养殖微藻的方法，既能保证微藻的快速生长，又能 大幅提高其油脂含量。本发明的目的之二是提供一种生产油脂的方法，该方法在实现目的 一的基础上，进一步解决微藻沉降采收过程中存在的问题，从而能以更低成本获得油脂。
[0008] -种养殖微藻的方法，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度大于30mmol/L，光 自养培养> 10天收获。
[0009] 优选的情况下，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度为40?200mmol/L。
[0010] 接种的方式既可以将藻种与培养基混合，也可以将含有藻种的藻液与培养基混 合。"接种后的氮肥浓度"是指按混合比例计算的平均氮肥浓度。
[0011] 所述的氮肥优选为硝酸盐或尿素。
[0012] 所述的微藻优选属于绿藻门，更优选为小球藻或栅藻，进一步优选为小球藻。
[0013] 根据本发明的方法，在培养微藻的过程中还需要维持微藻正常生长所需要的其它 必要条件，如提供合适的光照、温度，以及其它微藻生长所必须的营养成份，调控藻液中的 C〇2、溶解氧、水、无机盐、必要营养物质、pH值等在合适的范围内，使其适宜微藻的快速生长 与繁殖。这些技术是本领域技术人员所熟知的。
[0014] 一般地，培养温度为15?40°C，优选为25?35°C ;光强为2000?200000勒克 斯，优选为5000?150000勒克斯；在微藻培养过程中通入C02，并使藻液pH值在6?10的 范围内。
[0015] 不同种类的微藻对营养成分的质和量的需求会有不同。根据本发明的方法，藻液 中除氮肥外的其它营养成分可根据具体的微藻，参照现有培养基的配方进行配制。微藻对 营养盐的需求也有很多共同点，因此一些培养基的配方可应用于多种微藻的养殖，如BG11 培养基被广泛用于绿藻的养殖。本发明中，当所述微藻为绿藻时，可按照BG11培养基配制 藻液中除氮肥外的其它营养成分。
[0016] 本发明中，微藻的培养可以采用分级扩大的方式，比如藻种经过1L、5L、50L、 500L···逐级放大培养。接种的起始浓度一般可以控制在藻液光密度值（0D值）为0. 2?1 的范围内。养殖时间通常在10天以上，优选在15天以上。
[0017] 一种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻采收、微藻油脂的分离和提取，其中的 微藻养殖采用上述的方法。
[0018] 优选的情况下，微藻采收步骤包括：当藻液的光密度值0D_>1. 6且依赖微藻自身 生长使藻液pH值彡7时，在温度彡40°C的条件下，沉降24小时以上；然后在20°C?40°C 下，收获下层沉降的藻液，上层〇D_ < 0. 6的藻液返回微藻养殖步骤循环利用。
[0019] 试验发现，虽然采收时的藻液浓度很低(不到藻液质量的3%。），但藻液浓度仍对微 藻沉降有明显的影响，当藻液的光密度值〇D_ < 1. 6时，微藻十分难于沉降。根据本发明 的方法，需将藻液的光密度值〇D_控制在>1. 6,优选> 2,更优选> 3. 5,进一步优选> 7。
[0020] 试验发现，当藻液呈酸性时，微藻十分难于沉降。根据本发明的方法，需要将藻液 的pH值控制在>7。本发明不需要将藻液pH调节至强碱性，只需要依赖微藻自身生长导致 的藻液pH值上升使其处于非酸性状态即可。优选的条件下，依赖微藻自身生长使藻液pH 值为7?9时，再进行沉降。
[0021] 优选的情况下，当藻液的光密度值0D_>3. 5且依赖微藻自身生长使藻液pH值为 7?9时，再进行采收；更优选的情况下，当藻液的光密度值0D_>7且依赖微藻自身生长使 藻液pH值为7?9时，再进行采收。
[0022] 沉降深度可依据具体的微藻和现有技术确定，一般为50mm?1000mm，较佳的深度 为 50 ?120mm。
[0023] 试验发现，当温度<20°C时，轻微的藻液扰动，就会使沉降的微藻重新分散，因此需 要将收获温度控制在20°C?40°C。
[0024] 优选的情况下，返回微藻养殖步骤的藻液的0D_为0. 4?0. 6。
[0025] 在不违背本发明之目的且不相互矛盾的情况下，本发明中的各技术特征可任意组 合，其同样属于本发明公开的内容。
[0026] 本领域的技术人员熟知，采用氮饥渴的技术可以提高微藻的油脂含量，然而，该方 法不适合大规模工业生产，因为将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中过 程繁琐且能耗极高。此外，由于氮源的限制使细胞的分裂、生长受到限制，细胞活力下降而 导致生物量急剧下降，最后总的脂肪产量并未提升。传统的BG11培养基被广泛用于绿藻的 养殖，而传统的BG11培养基米用硝酸钠为氮源，且藻液中的N含量约为18mmol/L，米用传 统的BG11培养基可以使绿藻较好的生长，但是绿藻的油脂含量较低。经过研究，完全出乎 意料地发现，采用超出通常用量的高浓度氮源，不但可以使微藻具有较高的油脂含量，而且 使微藻具有较高的生长速率。本发明的技术方案揭示：当藻液的N含量远高于正常藻液的 N含量时，具体地说当N含量大于30mmol/L时，微藻不但可以快速的生长，而且所得到的微 藻油脂含量更高。此外，较高浓度的氮源(尿素）还大大降低了病虫害的发生。
[0027] 本发明提供的方法在规模养殖中具有较大的优势，操作简便易行，大量氮源(尿 素）的存在有助于病虫害的防治。更为重要的是，采用本发明的方案，既能保证微藻的正常 生长，又能使微藻积累较多的油脂。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 附图1是微藻养殖生长曲线。

【具体实施方式】
[0029] 下面以实施例详细说明本发明，但并不因此构成对本发明的限制。
[0030] 藻液光密度倌（0D^倌）测定：
[0031] 光密度值用分光光度计测定，以蒸馏水作对照，测定藻液在波长680nm处的吸光 值，作为微藻养殖浓度的指标。
[0032] 微藻含油量测定：
[0033] 采用索氏提取器测定，首先将适量藻液离心、干燥，仔细研磨成细粉一确保微藻有 效破壁，称量，用滤纸包裹放入提取器中，加入甲醇和三氯甲烷，在90°C下抽提6小时，将两 种混合溶剂烘干，恒重称取遗留下的物质，测得含油量的公式：含油％ =抽提物重（G)/干粉 重（G) 100%。
[0034] 微藻培养某的配制:
[0035] 按表1配方配制水溶液(表1中的微量元素 A5按表2配方配制)，使用时稀释成 1000倍的培养基。
[0036] 表 1

【权利要求】
1. 一种养殖微藻的方法，其特征在于，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度大于 30mmol/L，光自养培养> 10天收获。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度 为 40 ?200mmol/L。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮肥为硝酸盐或尿素。
4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微藻属于绿藻门。
5. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的微藻为小球藻或栅藻。
6. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于，按照BG11培养基配制藻液中除氮肥外的 其它营养成分。
7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，培养温度为15?40°C，光强为2000? 200000勒克斯，在微藻培养过程中通入C0 2，并使藻液pH值在6?10的范围内。
8. 按照权利要求7所述的方法，其特征在于，培养温度为25?35°C，光强为5000? 150000勒克斯。
9. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，培养15天以上收获。
10. -种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻米收、微藻油脂的分离和提取，其中的微 藻养殖米用权利要求1?9中任一的方法。
11. 按照权利要求10所述的方法，其特征在于，微藻采收步骤包括：当藻液的光密度值 0D68Q>1. 6且依赖微藻自身生长使藻液pH值彡7时，在温度彡40°C的条件下，沉降24小时 以上；然后在20°C?40°C下，收获下层沉降的藻液，上层OD_ < 0. 6的藻液返回微藻养殖 步骤循环利用。
12. 按照权利要求11所述的方法，其特征在于，返回微藻养殖步骤的藻液的OD_为 0. 4 ?0. 6。
13. 按照权利要求11所述的方法，其特征在于，当藻液的光密度值OD_>3. 5且依赖微 藻自身生长使藻液pH值为7?9时，再进行采收。
【文档编号】C12P7/64GK104232560SQ201310229352
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】荣峻峰, 周旭华, 朱俊英, 黄绪耕, 程琳 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院