一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种以微藻为原料生产2，3-丁二醇的方法。
【背景技术】
[0002]由于世界石油资源的枯竭和价格逐渐走高、环保问题日益严峻，以及全球气候变化引发一系列的影响，20世纪70年代以来，许多国家日益重视生物能源、生物基化学品和生物材料的发展。2, 3- 丁二醇(2，3-Butaned1l, 2，3-BD0)，是一种非常重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于食品、医药、建材、燃料以及航空航天等领域。目前合成2，3-丁二醇的方法有两种，化学法和生物法。化学法合成2，3- 丁二醇主要以石油裂解时产生的四类碳氢化合物在高温、高压下水解得到，同生物发酵法相比，化学合成成本高、过程繁琐、不易操作，一直难以实现大规模工业化生产。利用生物法生产2，3-BD0,即符合绿色化工的工业化要求，又可缓解能源危机符合国家的能源发展战略，成为近年来生物领域的新热点。
[0003]目前生物法生产2，3-BD0报道较多的以葡萄糖为碳源发酵，如果以传统玉米为原料存在与人争粮、与人争地的问题。CN1710086A公开一种利用糖蜜、淀粉或甘蔗汁为碳源发酵生产2，3-BD0的方法，但最终产物2，3-BD0浓度不高。CN101225408 A提供一种用纤维物质生产燃料乙醇和2，3- 丁二醇的方法，最大的瓶颈就是纤维素酶成本高。因此，寻求高效、低成本的2，3- 丁二醇生物制造技术一直是人们研究的目标，特别是高效利用廉价的生物质原料生产2，3- 丁二醇，不仅有助于进一步拓展2，3- 丁二醇的应用领域，还有助于解决生物基化学品生物制造技术中的共性瓶颈问题。
[0004]近年来，微藻因其结构简单、整个生物体都能进行光合作用，具有光合效率高、生长周期短、速度快的特点，同时通过调控可在细胞内能积累大量油脂、蛋白、淀粉等高附加值产品，迅速成为研究热点。但目前的研究主要集中于利用微藻生产生物柴油，如CN103571612A公开了一种利用微藻制备生物柴油的方法，CN103451101A公开了一种生产高品质微藻生物柴油的方法，CN102433362A公开了一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法。而在其它生物产品方面的应用鲜有报道。
[0005]微藻生长周期短，能有效地耦合光合作用和糖类生产，光合作用效率明显高于普通植物，淀粉累计可达细胞干重30%以上，同时还可将部分碳元素转化为其它化学品；微藻的培养不与农作物争地争水，可以利用废水中N、P等营养，从而降低水体的富营养化，节约水资源和营养盐成本。因此，利用非粮且可再生的微藻为原料发酵生产2，3-BD0，与其它生物质2，3-BD0相比，一定程度上能够降低成本，同时也为微藻下游产品的开发提供了一个新的途径。
[0006]CN200810228100.4公开了一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2，3_ 丁二醇的方法，是以富含淀粉中药材为原料，经液化、糖化得到糖化液，以糖化液为碳源，与灭菌后的无机盐营养成分混合，接入产2，3- 丁二醇的菌种，进行摇瓶发酵、批式发酵或通过补加固体葡萄糖，进行批式流加发酵，得到较高浓度2，3-丁二醇。该发明的原料预处理复杂，且需要流加葡萄糖不具有经济性。
[0007]CN200910015400.9公开了一种利用淀粉类原料生产2，3_ 丁二醇的方法，是将淀粉类原料经过A-淀粉酶和糖化酶处理，以糖化液或者液化液作为发酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作为发酵菌株，在无菌条件下通过分步糖化发酵或者同步糖化发酵来生产2，3- 丁二醇，最终2，3- 丁二醇的浓度达到43?112g/L，乙偶姻和2，3- 丁二醇的最终浓度达到45?121g/L。该专利所述的淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉等粮食类原料，存在“与人争粮”的问题。
【发明内容】
[0008]针对微藻淀粉含量低、水解糖量低及其他原料生产2，3- 丁二醇成本高的问题，本发明提供了一种以微藻为原料生产2，3-丁二醇的方法。本发明通过对微藻培养过程和水解过程的调控，提高了微藻淀粉含量及水解液中可发酵糖含量，最终获得了高浓度的2，3-BD0，具有处理工艺简单、成本低、产率高的特点。
[0009]本发明以微藻为原料生产2，3- 丁二醇的方法，包括如下内容:
(1)微藻培养:将微藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的微藻培养基继续培养，培养至稳定期获得微藻培养液；
(2)水解处理:在上述微藻培养液中加入蜗牛酶进行破壁处理，随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-150°C进行水解，获得微藻水解液；
(3)发酵培养:以得到的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，并采用克雷伯氏菌发酵生产 2，3-丁二醇。
[0010]本发明中，步骤(I)所述的微藻选用淀粉含量较高的绿藻，优选小球藻{Chi ore I Ia)、衣藻{Chlamydomonas)、栅藻iScemdesmus)等中的一种或几种。微藻培养基为常规培养微藻的培养基，如可以米用SE、TAP或BGll培养基。微藻种子液的是指将微藻接入培养基后培养至对数生长期获得的藻液；微藻培养时，控制微藻种子液的接种量为(占培养基体积，下同)为2v%-10v%。微藻种子液和微藻培养的具体条件如下:温度25-30° C,通气量 0.1-1.0vvm, CO2 含量为 lv%-3v%，搅拌转速 50-200 rpm, pH 6.0-8.0，光暗比 10:14-14:10ο
[0011]本发明中，步骤(I)所述的富含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入过量无机氮，如可以是NaNO3、NH4NO3、NH4Cl等，加入量为2.0-5.0 g/L ;所述的含微量N元素的微藻培养基是指降低常规微藻培养基中氮源的含量，加入量为0-0.5 g/L。
[0012]本发明中，步骤(I)所述的微藻培养可以采用常规的培养方式，如可以在通入CO2含量为lv%-3v%，光暗比为10:14-14:10的条件下进行富含N元素的微藻培养和含微量N元素的微藻培养。本发明优选米用以下方式培养:在富含N兀素的微藻培养基中培养时,通入的CO2含量为lv%-3v%，光暗比为10:14-14:10，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，同时将CO2的含量提高到3v%-5v%, pH调节为8.0-9.0，光暗比为18:6-24:0，培养至稳定期。通过上述培养，有助于加速微藻对环境的适应性和快速增殖，从而有助于提高藻液中淀粉含量。
[0013]本发明中，将微藻培养至稳定期获得淀粉含量较高的藻液，按照5_50mg/g藻液加入蜗牛酶对细胞进行破壁处理，控制破壁处理的PH值为5.0-8.0，温度为30-45° C。对藻细胞进行破壁处理，不仅可以将藻细胞内部的淀粉释放出来，提高淀粉水解的可及度，而且可以水解部分淀粉和细胞壁组分，显著降低后续水解难度。随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-120°C，保温10_60min。无机强酸选用硫酸或盐酸。微藻除了胞内含有大量淀粉以外，细胞壁中还含有纤维素、半纤维素等物质。采用蜗牛酶组合稀酸水解即能够将胞内淀粉水解成可发酵糖，还能将细胞壁中纤维素、半纤维素等一同水解成可发酵糖，提高了水解液中的可发酵糖含量。
[0014]本发明中，以步骤(2)制备的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，同时还包括:氮源(NH4)2HPO4 2.0-6.0 g/L，(NH4)2SO4 4.0-8.0 g/L ;无机盐 K2HPO4.3Η20 10.0-20.0 g/L，KH2PO4 1.0-5.0 g/L ;微量元素 MgSO4.7H20 0-1.0g/L, FeSO4.7H20 0-1.0g/L, ZnSO4.7H200-0.5 g/L, MnSO4.H2O 0-0.5 g/L, CaCl2 0-1.0g/L, EDTA 0-1.0 g/L, pH 值为 6.0-8.0。
[0015]本发明中，以克雷伯氏菌为发酵菌种制备2，3-丁二醇，优选克雷伯氏杆菌和产酸克雷伯氏菌。发酵菌种子液的制备方法如下:取活化的克雷伯氏菌，接种到含葡萄糖5-50g/L，酵母浸膏2-6 g/L，蛋白胨5-15 g/L，氯化钠5-10 g/L的培养基中，在温度35_40°C，转速 150-250rpm, pH 为 6.0-7.5 下培养 12_24h。
[0016]本发明中，将克雷伯氏菌种子