一种微量微藻细胞收集和破碎方法
【专利摘要】本发明利用微孔滤膜和吸水纸充分收集微量体积藻液中的藻细胞，在研磨剂辅助下通过研磨能够有效破碎微藻细胞。在使用不同方法破碎所述微藻细胞时，通过本发明能够有效提高细胞壁破碎效果。本发明是一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的微量微藻细胞收集和细胞壁破碎方法，在微藻相关源领域具有较好的应用价值。
【专利说明】
一种微量微藻细胞收集和破碎方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的微量微藻细胞收集和破碎方法。
【背景技术】
[0002]微生物收集常用方法包括离心法、沉淀法和过滤法。离心法在收集微量微藻细胞过程中存在一定缺陷，比如离心后藻细胞在转移过程中容易造成藻细胞损失，这会对后面微藻细胞成分含量分析等造成较大误差。沉淀法一般需要加入化学试剂，会对后面微藻细胞成分含量分析造成较大影响。常规过滤法需要施加高压或进行抽滤，操作较为复杂，且相关器具对微量微藻细胞的收集不适用。
[0003]微生物细胞壁破碎常用的方法主要包括超声波细胞破碎法、液氮研磨法、反复冻融法、高压均质破碎法、玻璃珠撞击破碎法等。其中超声波破碎法、氮研磨法、玻璃珠撞击破碎法和反复冻融法对小粒径微藻细胞的破碎效果往往并不理想;虽然高压均质破碎法对微藻细胞的破碎效果理想，但该方法的藻液最低处理量要一般都在2 ml以上，且要求藻液具有较高的细胞密度(如对小球藻而言，藻液密度一般要求大于5 X 16个/ml)。因此，目前通用的微藻破碎方法在用于破碎微量藻细胞(几百μ?)，且藻液中藻细胞密度较低时，破碎效果很差。在微藻相关研究中经常会遇到因藻液体积有限而不能大量取样的情况，此时就需要有能够处理微量藻细胞的收集和破碎方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于为了解决现有微藻破碎方法在用于破碎微量藻细胞，且藻液中藻细胞密度较低时，破碎效果很差的缺陷而提供一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的微量微藻细胞收集和破碎方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种微量微藻细胞收集和破碎方法，所述方法包括如下步骤:a)将藻液滴加至微孔滤膜，使用吸水材料吸取藻液中的液体，然后将微藻细胞从微孔滤膜上分离，得到干燥的微藻细胞；
b)将步骤a)得到的干燥的微藻细胞与研磨剂混合，-15°C至_10°C研磨30-45min后得到破碎的微藻细胞。在本技术方案中，本发明利用微孔滤膜和吸水纸充分收集微量体积藻液中的藻细胞，在研磨剂辅助下通过研磨能够有效破碎微藻细胞。实验证实，在使用不同方法破碎所述微藻细胞时，通过本方法能够有效提高细胞壁破碎效果。本发明是一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的微量微藻细胞收集和细胞壁破碎方法，在微藻相关源领域具有较好的应用价值。
[0006]作为优选，所述藻液的使用量为0.2-0.5mL，微藻细胞的细胞直径为1_2μπι，微藻细胞在藻液中的密度为5 XlOMV mL-5 XlOMV mL。
[0007]作为优选，步骤a)中，藻液在滴加到微孔滤膜前先放入反应爸中，通入臭氧与空气的混合气体并搅拌均勾，混合气体的通入速度为15-50mL/min，臭氧与空气的体积比为1:100。
[0008]作为优选，步骤b)干燥的微藻细胞在与研磨剂混合前先经液氮超低温冷冻。
[0009]作为优选，所述微孔滤膜为平板薄纸型滤膜或中空纤维膜，微孔滤膜的孔径为0.22μηι或0.1ym0
[0010]作为优选，研磨剂为棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯的混合物，其中，棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯质量比为1:5: 2:0.05，其中，棕刚玉、金刚砂与硅胶粉的粒径为10-15
μ??ο
[0011 ]作为优选，研磨剂的用量为藻液体积的2/5-1/2。
[0012]作为优选，所述藻液为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的重水培养液、蛋白核小球藻(Ch lore I la pyrenoidsa)的重水培养液或斜生棚.藻(Scenedesmus obliquus)的重水培养液;所述藻液中，微藻选自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidsa)和斜生棚.藻(Scenedesmus obliquus)中的至少一种。
[0013]作为优选，吸水材料为聚丙烯酰胺。
[0014]本发明的有益效果是:本发明利用微孔滤膜和吸水纸充分收集微量体积藻液中的藻细胞，在研磨剂辅助下通过研磨能够有效破碎微藻细胞。实验证实，在使用不同方法破碎所述微藻细胞时，通过本方法能够有效提高细胞壁破碎效果。与常规微生物细胞收集和细胞壁破碎方法相比，本发明具有如下优点:
1、技术新颖:该方法利用微孔滤膜、吸水材料和研磨剂等对微量藻液中的藻细胞进行有效收集、除水和破碎；
2、简便快捷:该方法对设备和技术的要求较低，不依靠超声波细胞破碎仪、高压均质机等细胞破碎设备;不需要经过长时间的浸提过程；
3、效果显著:该方法较常规微生物细胞收集和细胞壁破碎方法相比，能够有效克服现有破碎细胞法对藻液体积量的最低要求限制，能够显著降低微藻损失率、提高微藻破碎效果;
4、本发明是一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的微量微藻细胞收集和细胞壁破碎方法，在微藻相关源领域具有较好的应用价值。
【附图说明】
[0015]图1是本发明实施例与对比例显微镜下观察对比图。
[0016]图中，A为破碎前细胞结构;B为超声破碎后细胞结构;C为液氮研磨破碎后细胞结构;D为实施例1破碎后细胞结构。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0018]下面对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
下述实施例中，所用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )购自中科院淡水藻种库，产品编号为FACHB-359;蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidsa)购自中科院淡水藻种库，产品编号为FACHB-5;斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中科院淡水藻种库，产品编号为 FACHB-276。
下述实施例所用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidsa)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的重水培养液中，IL重水培养液的成分和用量如下:NH4CI 0.4g、K2HP040.108g、KH2P040.108g、MgS04.7H20 0.156g、CaCl2.2H20
0.05g、Tris(碱)2.42g、饱和盐酸 1.5ml、H3B03ll.4mg、MnCl2.4H20 5.06mg、ZnS〇4.7H200.22mg、FeS04.7H20 4.99mg、MoCl2.6H2O I.61mg、(NH4)6Mo7O24.4H201.57mg、冰乙酸Iml、CH3COONa.3H20 2g，重水996ml。
下述实施例所用微孔滤膜为平板薄纸型滤膜(直径为50mm，孔径为0.22微米，材质为混合纤维，购自上海新亚净化器件厂)。
[0019]实施例1
一种微量微藻细胞收集和破碎方法，所述方法包括如下步骤:a)将藻液滴加至微孔滤膜，使用吸水材料聚丙烯酰胺吸取藻液中的液体，然后将微藻细胞从微孔滤膜上分离，得到干燥的微藻细胞；
b)将步骤a)得到的干燥的微藻细胞与研磨剂混合，-15°C研磨30min后得到破碎的微藻细胞。
[0020]所述藻液的使用量为0.2mL，微藻细胞的细胞直径为1_2μπι，微藻细胞在藻液中的密度为5X1MV mL。
[0021 ]研磨剂为棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯的混合物，其中，棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯质量比为1:5:2:0.05，其中，棕刚玉、金刚砂与硅胶粉的粒径为10-15μπι。
[0022]研磨剂的用量为藻液体积的2/5。
[0023]实施例2
一种微量微藻细胞收集和破碎方法，所述方法包括如下步骤:a)将藻液在滴加到微孔滤膜前先放入反应釜中，通入臭氧与空气的混合气体并搅拌均匀，混合气体的通入速度为15mL/min，臭氧与空气的体积比为1:100;然后将藻液滴加至微孔滤膜，使用吸水材料聚丙烯酰胺吸取藻液中的液体，然后将微藻细胞从微孔滤膜上分离，得到干燥的微藻细胞；
b)将步骤a)得到的干燥的微藻细胞先经液氮超低温冷冻，再与研磨剂混合，-12°C研磨35min后得到破碎的微藻细胞。
[0024]所述藻液的使用量为0.3mL，微藻细胞的细胞直径为1_2μπι，微藻细胞在藻液中的密度为6X1MV mL。
[0025]研磨剂为棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯的混合物，其中，棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨稀质量比为1:5:2:0.05，其中，棕刚玉、金刚砂与娃胶粉的粒径为10-15μηι。研磨剂的用量为藻液体积的I /2。
[0026]实施例3
一种微量微藻细胞收集和破碎方法，所述方法包括如下步骤:a)将藻液在滴加到微孔滤膜前先放入反应釜中，通入臭氧与空气的混合气体并搅拌均匀，混合气体的通入速度为15-50mL/min，臭氧与空气的体积比为1:100;然后将藻液滴加至微孔滤膜，使用吸水材料聚丙烯酰胺吸取藻液中的液体，然后将微藻细胞从微孔滤膜上分离，得到干燥的微藻细胞； b)将步骤a)得到的干燥的微藻先经液氮超低温冷冻细胞再与研磨剂混合，-10°C研磨45min后得到破碎的微藻细胞。
[0027]所述藻液的使用量为0.5mL，微藻细胞的细胞直径为1_2μπι，微藻细胞在藻液中的密度为5 X 16个/ mL。
[0028]研磨剂为棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯的混合物，其中，棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨稀质量比为1:5:2:0.05，其中，棕刚玉、金刚砂与娃胶粉的粒径为10-15μηι。研磨剂的用量为藻液体积的3/5。
[0029]对比实施例
(I)液氮冷却研磨法:取处于对数生长期的蛋白核小球藻溶液0.2 ml(藻液中蛋白核小球藻的细胞密度为I X 15个/ml)于1.5 ml离心管中，离心(6000 rpm, 10 min)，弃去上清液，用80%Ca(N03) 2溶液冲洗沉淀2次，向离心管中加入液氮，用圆顶竹棒迅速研磨，反复研磨多次至离心管底部加入液氮研磨时不再有绿色为止，于显微镜下观测研磨效果。
[0030]如附图1B所示，从图中可以看出经液氮研磨后，蛋白核小球藻的细胞结构依然十分完整，与破碎前(图1A)的细胞差异不大，细胞破碎效果很差。
[0031](2)超声波破碎法:取处于对数生长期的蛋白核小球藻溶液5 ml于15 ml玻璃闭塞管中，于冰浴环境下使用超声波细胞破碎仪超声(吕学兰方法:400W，超声ls，间隔ls，总共时长20 min)，于显微镜下观测细胞破碎效果。
[0032]超声波细胞破碎法对蛋白核小球藻的破碎效果并不理想，破碎前后差异不明显。如图1C所示，从图中可以看出超声后蛋白核小球藻的细胞结构依然十分完整，与破碎前的细胞(图1A)差异不大，细胞破碎效果很差。
[0033]蛋白核小球藻经本发明破碎后，对蛋白核小球藻的破碎效果十分明显，破碎前后细胞结构差异显著。如图1D所示，从图中可以看出经本发明破碎后，蛋白核小球藻的细胞结构大部分已经不完整，细胞破碎效果很好。
[0034]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1.一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:a)将藻液滴加至微孔滤膜，使用吸水材料吸取藻液中的液体，然后将微藻细胞从微孔滤膜上分离，得到干燥的微藻细胞； b)将步骤a)得到的干燥的微藻细胞与研磨剂混合，-15°C至_10°C研磨30-45min后得到破碎的微藻细胞。2.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，所述藻液的使用量为0.2-0.5mL，微藻细胞的细胞直径为1-2μπι，微藻细胞在藻液中的密度为5 X 105个/mL-5X106f/ mL。3.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，步骤a)中，藻液在滴加到微孔滤膜前先放入反应釜中，通入臭氧与空气的混合气体并搅拌均匀，混合气体的通入速度为15-50mL/min，臭氧与空气的体积比为1:100。4.根据权利要求1或3所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，步骤b)干燥的微藻细胞在与研磨剂混合前先经液氮超低温冷冻。5.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，所述微孔滤膜为平板薄纸型滤膜或中空纤维膜，微孔滤膜的孔径为0.22μπι或Ο.?μπι。6.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，研磨剂为棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯的混合物，其中，棕刚玉、金刚砂、硅胶粉与石墨烯质量比为.1:5:2:0.05，其中，棕刚玉、金刚砂与硅胶粉的粒径为10-15μπι。7.根据权利要求1或6所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，研磨剂的用量为藻液体积的2/5-1 /2。8.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，所述藻液为莱茵衣藻(Chlamydomonas re inhardt i i )的重水培养液、蛋白核小球藻(Chlore I Iapyrenoidsa)的重水培养液或斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的重水培养液;所述藻液中，微藻选自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、蛋白核小球藻(Ch1rellapyrenoidsa)和斜生棚.藻(Scenedesmus obliquus)中的至少一种。9.根据权利要求1所述的一种微量微藻细胞收集和破碎方法，其特征在于，吸水材料为聚丙烯酰胺。
【文档编号】C12R1/89GK105861311SQ201610020213
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年1月13日
【发明人】葛亚明, 刘俊稚, 孙静亚
【申请人】浙江海洋学院