一种神经干细胞的大规模制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种神经干细胞（neural stem cells,NSCs)的大规模制备方法，具体 涉及NSCs的分离、培养和干细胞纯化及大规模扩增培养NSCs的方法及其在细胞移植、干细 胞培养、组织工程，再生医学和药学方面的应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化潜能。近 年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、胰腺、神 经组织、骨骼、肌腱等。
[0003] 因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs)、人外周血干细胞、人胚胎来源的干细胞如肝干细胞和神经干细胞、脐带血造 血干细胞及胎盘或脐带间充质干细胞。
[0004] 干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体 中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力仅维持8周左右；根 据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最 早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原 始的生殖干细胞及成体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织干细胞(如NSCs、肝干细胞、 胰岛干细胞等)。
[0005] 神经干细胞（nerve stem cells，HSCs)是来源于神经组织的干细胞或前体细胞。 有研究表明，神经干细胞可以分化为神经元、神经胶质细胞和造血细胞等多种细胞。
[0006] 现阶段人胚胎神经组织的分离和培养主要是从健康孕妇8~20周孕龄的胎儿， 无菌条件下分离胚胎神经组织，制备成细胞悬液后接种于含有碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子（EGF)和B27因子的无血清培养液中，接种密度为IX IO5Ail。生长 为神经细胞球后，用胰酶进行传代，接种密度为（7. 5~10) XlOVml ;再次长成神经细胞球 后用于移植手术。此制备方法可有效地从胎儿神经组织中分离到NSCs，但其缺点是一次只 能从胎儿神经组织中最多分离到IO9的神经细胞，经培养后NSCs的数量仅为108。用原始的 方法提取的神经干细胞，只能用于1-2个病人，加之胎脑来源有限，很大程度上限制了 NSCs 的临床推广应用。
[0007] NSCs来源与扩增困难是限制其成为药物研发的主要障碍。
[0008] 名称为"一种神经干细胞制剂、其制备方法及其用途"的发明专利申请(专利号： ZL02100859. 0,授权公告号：CN1194086C)揭示了一种神经干细胞制剂的制备方法，该方法 采用人胚胎脑组织用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后机械吹打为单细胞悬液， 加入培养基，在C02、37°C下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞。分离 培养的神经干细胞，在体外传3-6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到的神经干细胞 制剂。但是，该方法应用剪碎法加酶消化法提取的神经干细胞，细胞数仅为1〇7个胎脑，如 按平均每例使用5X107个神经干细胞计算，只能用于1-2个病人，难以进行神经干细胞的 新药研究和临床应用需求。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供了一种神经干细胞的大规模制备方法。
[0010] 本发明所述的规模化制备神经干细胞的方法，包括以下步骤：
[0011] A、幼年动物或胚胎脑组织，称重，按1 :2加入0. 1M/L磷酸盐缓冲液（PBS)，采用电 动机械法绞碎或匀浆；
[0012] B、离心，去上清，沉淀用10-100倍体积的0. 01%的胶原酶或胰酶37°C搅拌消化30 分钟，离心，用0.1 M PBS洗涤1~3次；
[0013] C、用10-100倍体积的0.1 MPBS液将沉淀洗出，加胶原酶、蛋白酶K、DNase继续搅 拌消化30分钟，0.1 M PBS洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.1 MPBS洗出上层悬浮细胞， 过滤，离心后取细胞悬液进行细胞计数；
[0014] D、取上述细胞按I X 105/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加 bFGF、EGF 和牛血清白蛋白，当培养中神经干细胞生长为神经细胞球后，采用胰酶消化法收集神经干 细胞，传代，接种密度为IX IO5Ail继续培养；
[0015] E、进行大规模(摆瓶法、转瓶法或发酵罐法）细胞扩增，同时保持细胞未分化；
[0016] F、当细胞扩增10-100倍后收集细胞，按1-2 XioVml进行细胞冻存，备用；
[0017] G、细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。
[0018] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述神经组织来 源是选自：灵长类、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马的幼年动物或胎儿动物的大脑、小脑、中脑 或脊髓。
[0019] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤A中， 所述的机械法包括：电动法(组织绞碎机，研磨机和匀浆机等)，匀浆速度和处理时间由组织 匀浆液的均匀度和细胞存活率决定，不做具体规定。
[0020] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤A中， 所述的加 PBS的比例为：PBS的重量：神经组织重量为1-100 :1之间的任一比例，优选为10 : 1〇
[0021] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤B中， 所述的胶原酶浓度可为〇. 001%-1%，根据所用胶原酶的活力单位决定，所消化的时间因温度 不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0. 01%的II胶原酶 37 °C消化30分钟。
[0022] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤B中， 所述的胰酶浓度可为〇. 〇〇1%_1%，根据所用胰酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同 可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0. 0125%的胰酶37°C消 化30分钟。
[0023] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤E中， 所述的方法为摆瓶法或转瓶法培养，和内加或不加支持物(如磁株、胶原、明胶和琼脂等有 型物）的摆瓶法或转瓶法培养。
[0024] 根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述的摆瓶法 或转瓶法主要是使神经干细胞处于悬浮状态生长，加入胶原或明胶等有型物的浓度可为 〇%_1% ;摆瓶法的转速为55-65次/分钟。
[0025] 优选地，胶原浓度为0. 01%，明胶的浓度为0. 005%。
[0026] 本发明还提供了将本发明所述方法制备的神经干细胞的用途，包括：用于制备治 疗神经系统疾病如病毒性脑炎、脑萎缩、遗传性小脑共济失调、侧索硬化、脑外伤、脑血管 病、帕金森氏病、老年性痴呆的药物制剂，以及检测诊断试剂的用途。
[0027] 本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法是综合采用电动匀浆法加酶促消化 法，从幼年动物或胎儿动物神经组织中提取神经干细胞（NSCs)，可明显提高神经干细胞收 率，细胞数可达到1-10X IOicVlOg神经组织。本方法采用机械法与联合酶法相结合的办法， 分离的神经细胞数量成10倍的增加，加之扩增培养技术的改进，NSCs数量可达传统方法的 10倍至1000倍，因此，本方法的成功实施，可为NSCs的临床推广应用打下坚实的基础，并有 可能将其作为NSCs药物进行开发研究。
【附图说明】
[0028] 图1是神经干细胞移植前后各组实验动物行为学变化及脑梗死体积比较图。
[0029] 图2是脑组织外观及HE染色图。
【具体实施方式】
[0030] 发明人在多年干细胞的研究中发现，从胎鼠脑组织中可分离到NSCs，之后又从人 胎脑中分离到NSCs,但分离到的NSCs数量极小，难以满足临床需求，因此，NSCs的产量成 为了其大规模临床应用的主要瓶颈。自2010年12月始，立项进行NSCs产量的研究，经多 次工艺改造后使神经细胞从原有的1〇7/次增加到现在1〇9_1(7次，经培养扩增后细胞数可达 IOich11/次，NSC细胞数量增加约10倍-1000倍；大大方便了临床操作。
[0031] 经发明人反复探索，发现采用机械法（电动）可有效地从神经组织中分离NSCs， 经胶原酶和胰酶联合搅拌消化，细胞数明显增加，经15-20天的培养扩增，细胞总数可达 IOich11个/次，其中干细胞比例可达10-20%，此NSCs可低温长期保存，大大方便了临床操作。
[0032] 采用此方法分离，提取，培养扩增所得的细胞，细胞数量和质量稳定，可能/可以 做为干细胞药物进