专利名称：胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，特别是一种胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。
背景技术：
1988年，Rousselet等发现神经胶质细胞的条件培养液具有神经营养作用，1993年美国华裔科学家Lin等从神经胶质瘤细胞条件培养液中纯化了这种具有神经营养作用的蛋白质，克隆其基因并将之命名为胶质细胞源生神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor, GDNF)。随后的大量研究表明，GDNF不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且对运动神经元、去甲肾上腺素神经元、外周感觉神经元和交感神经元都有很强的促存活作用；而且GDNF对发育中的运动神经元也有良好的营养作用。GDNF对运动神经元的作用在迄今发现的所有神经营养因子中是活性最强的一个，可以促进运动神经元的存活、分化及代谢功能，对胚胎期或出生后损伤的运动神经元都有很强的修复作用。GDNF的这种对运动神经元所具有的修复损伤作用，为运动神经元性疾病(如脊髓损伤)的治疗开辟了新途 径。然而，⑶NF是一种生物大分子，难以通过血脑屏障，因而很难直接转移到中枢神经系统。此外尽管GDNF在哺乳动物体内分布较广，但其含量甚微，因此我们利用基因工程的方法以期获得高产量的活性因子用于脊髓损伤的治疗。长期以来，许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗是临床攻克的难题。应用细胞因子直接注射(一次性治疗)或神经组织移植(细胞替换)疗效有限，且一些神经遗传性疾病以及需合适微环境的神经再生的治疗，仅用细胞介导疗法很难达到理想的效果。因此人们想通过基因治疗来解决这些问题。然而体内基因治疗(in vivo)存在某些缺陷，如携带外源基因的载体很难特异性靶向神经细胞或组织区域，而且也不能替换死亡的神经元。间接体内基因疗法(ex vivo)虽已应用于脊髓损伤的移植治疗，但是载体细胞的选择较为困难。作为中枢神经系统基因治疗的载体细胞应当符合下例条件:①易于获取和增殖，包括许多已建株的细胞和胚胎及新生期幼稚细胞载体细胞经转基因处理后移植到脊髓内仍能具有成活和分裂能力载体细胞在脊髓内不能造成浸润生长，以免局部成为轴突生长的障碍，甚至形成肿瘤；④载体细胞在体内应能长期持续表达所携带的目的基因；⑤免疫原性小；⑥载体细胞能自身分泌某些营养物质如细胞外基质最为重要的是载体细胞或其衍生的细胞能替换死亡的神经元或能使已脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。近年研究提示,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)不仅可在体外大量扩增，而且回输到体内可以长期存活、适当整合于中枢神经组织且可分化成神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞能并稳定表达外源基因，因此是一种理想的载体细胞。尽管NSCs可产生一系列神经营养因子如⑶NF，BDNF, NGF, NT-3, NT_4/5[57]，但这些因子表达有限因而作用甚微。因此，GDNF修饰的胚胎NSCs的构建为神经系统疾病，尤其是脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等疾病提供了新的更好的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是构建一种胶质细胞源生神经营养因子基因(GDNF)修饰的胚胎神经干细胞(NSCs)。所构建的⑶NF-NSCs对神经元具有明显的促存活作用，对多巴胺神经元具有重要的营养作用，同时仍然保持了 NSCs的干细胞特性，且回输体内后长期存活并可分化成稳定表达外源基因的神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞，为许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗提供了新方法。技术方案本发明的目的是按如下技术方案实现的。胶质细胞源生的神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:它按如下步序进行:(I)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/⑶NF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切 酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收 DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒PLNCX2-GDNF转染包装细胞PT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为PT67-GDNF)。(5) PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定，将PT67-GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并筛选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM-F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将PT67-GDNF细胞上清液感染NSCs,并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9) Western印迹鉴定⑶NF_NSCs，抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。(10) ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，将⑶NF-NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定⑶NF的含量。(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测⑶NF的生物活性。所述步序(I)采用的大肠杆菌是TGl，培养基是LB，质粒pSK/⑶NF和pLNCX2阳性克隆用的抗药基因是Amp，37°C培养12-16小时后挑取阳性菌落常规进行质粒的抽提与纯化。所述步序(2)采用的限制性内切酶分别是HindIII和Notl，总反应体积为200μ 1，反应温度和时间分别是37°C水浴2小时，DNA回收用琼脂糖凝胶电泳法和DNA纯化试剂盒。所述步序⑶连接酶是T4 DNA ligase，连接温度和时间是16°C、14小时，挑选阳性克隆的标准是:直径2-3mm、光滑、湿润、中央隆起的菌落；阳性克隆用质粒纯化试剂盒和琼脂糖凝胶电泳法回收纯化质粒DNA，鉴定用Hind III和Not I酶切看目的基因片段。目的基因⑶NF序列测定采用大鼠⑶NF基因的引物，上游:5’ -TGG GAT GTC GTG GCT GTC TG-3，;下游:5’-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。所述步序(4)包装细胞pT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)，质粒pLNCX2-GDNF转染用Lipof ectamineTM2000 (脂染明)和 4-8 μ g/ml poly-brene 介导，阳性克隆 pT67_GDNF 的筛选用 500 μ g/ml G418。所述步序(5)PCR采用的引物是Neo基因序列，上游为:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游为:5’ -CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’，扩增产物用琼脂糖凝胶(1.0%凝胶)鉴定。所述步序
(6)病毒滴度测定用的是小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞，培养基是DMEM完全培养基加10%的小牛血清培养； 收集24小时的pT67-GDNF细胞培养上清液感染NIH 3T3细胞，阳性克隆的筛选用400 μ g/ml G418。所述步序(7)消化用Trypsin的浓度是0.25%,NSCs的培养基是DMEM-F12液中含5-10μ g/ml肝素、1% N2和青/链霉素各100单位、10% EGF和10%FGF-2，NSCs冻存液是10% BSA加7.5% DMS0。所述步序⑶病毒液的收集用处于对数生长期(培养14-17小时)的pT67-GDNF细胞上清液，添加4_8 μ g/ml poly-brene,感染干细胞8小时，阳性克隆用100 μ g/ml G418筛选筛选。阳性克隆的免疫组织化学鉴定:神经球经固定冰冻切片后，免疫组化一抗是兔抗大鼠⑶NF与小鼠抗大鼠nestin，二抗是FITC标记的羊抗兔IgG与Rhodamine标记的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,荧光显微镜观察并拍照。所述步序(9)WeStern印迹用细胞蛋白抽提液由0.lmol/L NaCl,
0.01mol/L ρΗ7.6Tris-Cl，0.001mol/L pH8.0 EDTA,I μ g/ml Aprotinin,100 μ g/ml PMSF组成，免疫化学染色用的一抗是兔抗大鼠IgG(按1: 500稀释)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀释于5% BSA),显色用邻苯二胺。所述步序(10)样本和蛋白标准液用Block & SampleI XBuffer分别稀释，蛋白标准液原浓度为2 μ g/ml，两者分别稀释成2，000、1，600、1，200、800和400pg/ml，实验用量为100 μ 1，室温振荡(500rmp)时间是6小时，一抗是抗人⑶NF多克隆抗体的稀释度是1: 500，二抗是HRP标记的抗鸡IgY抗体，室温2小时后显色并计算GDNF的含量。所述步序(11)采用的是清洁级SD大鼠，中脑多巴胺组织块用0.25%Trypsin 37°C消化，细胞培养盖玻片用多聚赖氨酸(0.005 0.01%w/v)包被，培养液是神经干细胞基础培养液加10%的FBS。实验设三组:Dopa+NSCs-GDNF组、Dopa+NSCs组、Dopa组。转基因干细胞、干细胞或N2培养液分别加入上述三组多巴胺细胞培养瓶，培养7天后进行免疫组化染色，一抗是小鼠抗大鼠TH单抗150 μ I，二抗是荧光标记的羊抗小鼠二抗(1: 50) 150 μ I,封片用Gel/mount+Hoechst,突光显微镜观察、拍照。
图1是重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-GDNF的构建，图2是重组质粒pLNCX2-GDNF酶切图谱分析，图3是pT67-GDNF细胞Neo基因PCR产物分析，图4是PT67-GDNF上清液所含病毒滴度的测定，图5是E14.5 SD大鼠大脑皮质NSCs体外培养5天(Pl)，神经球形成和Nestin表达，图6是转基因神经干细胞免疫组化染色鉴定，图7 是 NSCs-GDNF 细胞抽提物 Western blot 分析，
图8是ELISA法对转基因神经干细胞分泌的⑶NF定量分析， 图9是NSCs-GDNF上清液对E 14.5 SD大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元体外培养免疫荧光染色。
具体实施例方式通过本具体实施方式
说明本发明胶质细胞源生的神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。按如下步序操作:(I)质粒转化大肠杆菌，将TGl大肠杆菌接种于LB培养基，以制备感受态大肠杆菌。同时将含目的基因胶质细胞源生的神经营养因子基因(GDNF)的质粒pSK/GDNF和逆转录病毒载体质粒PLNCX2分别加入到感受态细胞悬液中，并转移到含Amp.的100mm LB平板，倒置平皿于37°C培养12-16小时后可出现菌落。挑取阳性菌落进行质粒的抽提与纯化。
(2)限制性内切酶消化质粒，在一次性200 μ I Eppendorf管内依次加入ddH20I μ 1、Buffer2 μ 1、DNA15 μ I (纯化的 pSK/GDNF 质粒或 pLNCX2 质粒)、HindIII 和 NotI 各1μ 1，低速离心(使可能粘于管壁的酶进入溶液)后37°C水浴箱水浴2小时进行酶切反应，产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳法回收DNA并纯化。(3)目的基因与载体的连接和转化及克隆鉴定，经过酶切且胶回收的目的⑶NF和载体PLNCX2大片段DNA，在T4 DNA Iigase连接酶的作用下经16°C反应14小时后，转化大肠杆菌。挑选转化体(要求直径2-3mm、光滑、湿润、中央隆起)进行克隆鉴定:即用HindIII和Not I酶切纯化的质粒，琼脂糖凝胶电泳观察并将位于目的基因处的胶块割下回收，命名为pLNCX2-GDNF质粒(见图1)。重组质粒经酶切得到的产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，上述所得GDNF片段约为720bp，与核酸标准分子量564bp条带相比，该条带位置正确(见图2)。⑶NF基因全长序列的测定:大鼠⑶NF基因的引物设计根据Genebank大鼠⑶NF基因全长序列(为700bp)，应用引物设计软件primer 5版本得到一对引物，上游:5’-TGG GAT GTCGTG GCT GTC TG-3’；下游:5’_CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。测序结果与大鼠⑶NF基因序列完全一致。(4)重组逆转录病毒的包装，成纤维细胞PT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)，置37°〇、5%0)2细胞培养箱培养(以下细胞培养均同)，3-4天换液一次。一周左右，细胞汇合度达80%时传代，按LipOfectamineTM2000(脂染明)说明书操作将质粒 PLNCX2-GDNF 转染包装细胞，并补充 4-8 μ g/ml poly-brene，用 500 μ g/ml G418筛选阳性克隆(暂时命名为PT67-GDNF)。(5) PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，抽提与纯化pT67-GDNF细胞基因组DNA，设计Neo基因序列引物，上游为:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游为:
5’ -CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3 ’。PCR扩增产物行琼脂糖凝胶(1.0%凝胶)电泳观察、拍照。图3表明:pT67-GDNF细胞基因组抽提物PCR产物在800bp处有一致密的DNA条带，对照组(pT67细胞)无条带出现。(6)病毒滴度的测定，用于病毒滴度测定的小鼠成纤维细胞NIH 3Τ3细胞用DMEM完全培养基加10%的小牛血清培养，同时pT67-GDNF细胞培养上清液收集用于病毒滴度的测定之用。收集24小时pT67-GDNF细胞培养上清液，作O、10、100、1000、10000倍等不同浓度的稀释，加于NIH 3Τ3细胞培养六孔板，并加入10% FCS和poly-brene培养12小时。撤去病毒液并加条件培养基继续培养，400 μ g/ml G418筛选抗性克隆。当对照(一组是4-8 μ g/ml poly-brene作用的NIH 3T3细胞，另一组为正常培养组)细胞全部死亡，计数重组病毒感染组阳性细胞克隆数。图4显示:G 418筛选两周后获得一病毒滴度为1.2X105TU (转导单位)/ml阳性克隆N0.7。(7)胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕14天的SD大鼠大脑皮质组织块，修理成约Imm3大小并用0.25% Tr ypsin消化,加D_Hank’s液吹打组织使成单个细胞。加入IOmg/L Dnase I室温约3_5分钟，离心弃去上清液，细胞沉淀用DMEM-F12基础培养液重悬并培养(DMEM/F12基础培养液配制:在DMEM-F12液中加入5_10 μ g/ml肝素、I % N2和青/链霉素各100单位，10% EGF和10% FGF-2用时再加)传代。神经干细胞的冻存用10% BSA和7.5% DMSO为冻存液。图5显示:E14 SD大鼠大脑皮质NSCs体外培养5天(Pl)，神经球形成和Nestin表达，A，自由漂浮的神经球；B、C和D分别是神经球经冰冻切片后进行的Hoechst 33342核标记、抗Nestin免疫突光染色和Hoechst 33342+Nestin双染色结果。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及转基因干细胞鉴定，将处于对数生长期的PT67-GDNF细胞上清液换成DMEM/F12基础培养液，37°C、5 % CO2培养箱培养14-17小时并收集上清液。传代的NSCs (Pl)形成一定大小的小球时用，上述病毒液重悬并增补10%EGF、10% FGF-2和4-8 μ g/ml poly-brene, 37°C>5% CO2培养箱培养8小时后撤去病毒液，换成NSCs条件与新鲜基础培养液(比例为1:1)的混合液。培养并用100 μ g/ml G418筛选，获得阳性克隆⑶NF-NSCs。免疫组织化学鉴定:神经球经4%多聚甲醛/PBS液4°C固定过夜、30%的多糖4°C过夜，加OCT组织包埋剂包埋后作15 μ m的冰冻切片。免疫组化一抗是兔抗大鼠⑶NF与小鼠抗大鼠nestin, 二抗是FITC标记的羊抗兔IgG与Rhodamine标记的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,突光显微镜观察并拍照。从图6可以看出:经nestin和⑶NF染色并用Hoechst作核标记发现，转基因神经球显示⑶NF强阳性，而野生型神经干细胞呈极其微弱的阳性。(9) Western印迹鉴定⑶NF-NSCs,将待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs加细胞蛋白抽提液(0.lmol/L NaCl,0.01mol/L ρΗ7.6 Tris-Cl，0.001mol/L pH8.0 EDTA,I μ g/mlAprotinin, 100 μ g/ml PMSF) 100-150 μ 1，吹打使神经球裂解并抽取蛋白，行Western印迹并进行免疫化学染色。后者采用的一抗是兔抗大鼠IgG(按1: 500稀释)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀释于5% BSA)，显色用邻苯二胺(DAB，稀释液按1: 50)，以此稀释液再按1: 50稀释DAB。图7显示=NSC-GDNF的免疫反应性明显较野生型NSCs强。(10) ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，常规方法进行酶标板的包被，用Block &Samplel XBufTer分别稀释样本和蛋白标准液。后者原浓度为2 μ g/ml，分别稀释成2，000、1，600、1，200、800和400 8/1111。用多孔加样器加100 μ I的样品和蛋白标准液于酶标板，室温振荡(500rmp)6小时后加入用Block & Sample I XBuffer稀释抗人⑶NF多克隆抗体(I: 500)，混匀，避免产生气泡，4°C过夜。HRP标记的抗鸡IgY抗体加入，室温2小时后显色(加100 μ I TMB One Solution,室温15分钟)并计算⑶NF的含量。从图8可以看出:NSCs-GDNF每日所分泌的⑶NF量为51ng/ml每百万个细胞，而野生型NSCs分泌量小于Ing/ml。这些结果表明工程细胞NSCs-GDNF能够表达高剂量的外源性⑶NF。(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测，取清洁级SD大鼠中脑多巴胺组织块，把组织块剪碎成约Imm3的方形块，用0.25% Trypsin 37°C消化、离心、弃去上清液，细胞沉淀用DMEM-F12重悬并接种于已经加入经多聚赖氨酸(0.005 0.01% w/v)包被的细胞培养盖玻片的六孔板或十二孔板，加2ml或Iml神经干细胞基础培养液，并加10%的FBS培养鉴定为多巴胺神经细胞，并分为三组:Dopa+NSCs-GDNF组、Dopa+NSCs组、Dopa组。这三组的细胞培养液分别是NSCs-GDNF细胞(P1，经G418筛选的阳性克隆神经球当代为PO)培养上清、(P2) NSCs培养上清液、N2培养液，各组多巴胺神经元培养7天后进行免疫组化染色。一抗是小鼠抗大鼠TH单抗150 μ I，置湿盒内4°C过夜，洗涤后加荧光标记的羊抗小鼠二抗(I: 50) 150μ 1，置湿盒内37°C避光孵育I小时。在载玻片上滴加Gel/mount (Biomeda)一滴，将coverslip反盖在载玻片上(细胞面朝下且注意不要产生气泡)，用荧光镜观察并拍照。图9表明:NSCs-GDNF 条件培养液组有大量TH-阳性神经元生长并有较长的突起形成；野生型NSCs条件培养液组TH-阳性神经元较少；原代多巴胺能神经元单独培养，3天后神经元开始死亡至7天，TH-阳性神经元已很少。
权利要求
1.胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:它按如下步序进行: (1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体PLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。
(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。
(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。
(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒PLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67-GDNF)。
(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。
(6)病毒滴度的测定，将PT67-GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并师选抗性克隆。
(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM-F12培养液培养传代。
(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将PT67-GDNF细胞上清液感染NSCs，并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。
(9)Western印迹鉴 定⑶NF-NSCs,抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。
(10)ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，将⑶NF-NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定⑶NF的含量。
(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测⑶NF的生物活性。
2.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(I)质粒转化大肠杆菌，将TGl大肠杆菌接种于LB液体培养基，以制备感受态大肠杆菌。同时将含GDNF的质粒pSK/GDNF和质粒pLNCX2分别加入到感受态细胞悬液中，转至LB平板培养并挑取阳性菌落进行质粒的抽提与纯化。
3.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(2)限制性内切酶消化质粒，使用HindIII和NotI分别消化纯化的pSK/⑶NF质粒和pLNCX2质粒，琼脂糖凝胶电泳法进行DNA回收。
4.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(3)目的基因与载体的连接、转化及克隆鉴定，经过酶切且胶回收的目的⑶NF和载体pLNCX2大片段DNA在T4 DNA Iigase连接酶的作用下，经16°C反应14小时后，转化大肠杆菌。阳性克隆用Hind III和Not I酶切纯化的质粒，命名为pLNCX2-GDNF质粒。其鉴定采用⑶NF基因全长序列的测定法，使用的一对引物上游:5’ -TGG GAT GTCGTGGCT GTC TG-3，:下游:5，-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3，。
5.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序⑷重组逆转录病毒的包装，成纤维细胞PT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)培养，细胞汇合度达80 %时用Lipofectamine 2000 (脂染明)将质粒pLNCX2_GDNF转染包装细胞pT67，G418筛选阳性克隆并定名为PT67-GDNF。
6.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(5) 0 鉴定重组逆转录病毒的包装，？了67-60即细胞基因组0嫩的抽提与纯化，设计Neo基因序列设计的一对引物，上游为:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游为:5’-CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’。进行PCR扩增并行琼脂糖凝胶(1.0%凝胶)电泳观察、拍照。。
7.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(6)病毒滴度的测定，收集24小时pT67-GDNF细胞培养上清液，作O、10、100、1000、10000倍等不同浓度的稀释，加于NIH 3T3细胞培养六孔板，并加入10 %FCS和poly-brene培养12小时。撤去病毒液并加条件培养基继续培养，G418筛选抗性克隆。
8.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(7)胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕14.5天的SD大鼠大脑皮质组织块，0.25% Trypsin消化成单个细胞，用DMEM/F12培养液(DMEM-F12液中加入5-10 μ g/ml肝素、1% N2和青/链霉素各100单位，10% EGF和10% FGF-2用时再加)培养、传代，用10% BSA和7.5% DMSO为冻存液冻存干细胞。
9.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，收集对数生长期的 丁67-60即细胞上清液，加入吧08( 1)细胞培养液中，以4-8 μ g/ml poly-brene促进感染，阳性克隆用100 μ g/ml G418筛选。免疫组织化学鉴定:神经球经固定后作冰冻切片，免疫组化染色一抗是兔抗大鼠⑶NF与小鼠抗大鼠nestin，二抗是FITC标记的羊抗兔IgG与Rhodamine标记的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,突光显微镜观察并拍照。
10.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(9)western印迹鉴定⑶NF-NSCs,用细胞蛋白抽提液(0.lmol/LNaCl,0.01mol/L ρΗ7.6 Tris-Cl,0.0Olmol/L pH8.0 EDTA,I μ g/ml Aprotinin,100 μ g/mlPMSF)抽提GDNF-NSCs细胞蛋白，行SDS-PAGE胶蛋白电泳并进行免疫化学染色，一抗是兔抗大鼠IgG (按1: 500稀释)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀释于5% BSA)，用邻苯二胺(DAB)显色。
11.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(10)ELISA测定⑶NF-NSCs上清液中⑶NF含量，样本和蛋白标准液分别稀释成2，000、1，600、1，200、800和400pg/ml，分别加100 μ I的样品和蛋白标准液于酶标板，一抗是抗人⑶NF多克隆抗体(I: 500)，二抗是HRP标记的抗鸡IgY抗体加入，用TMB One Solution显色并计算GDNF的含量。
12.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(11)⑶NF-NSCs生物活性检测，实验分三组:Dopa+NSCs-GDNF组、Dopa+NSCs组、Dopa组，培养液分别为NSCs-GDNF和NSCs培养上清液，以及N2培养液。多巴胺神经元(Dopa)取自清洁级14.5天SD大鼠中脑组织块。各组细胞培养7天后进行免疫组化染色， 一抗是小鼠抗大鼠TH单抗，二抗是荧光标记的羊抗小鼠二抗。
全文摘要
本发明涉及一种生物技术，具体是胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。它是按如下步序操作(1)质粒的转化；(2)质粒的消化纯化；(3)目的基因和载体的克隆；(4)重组质粒的包装；(5)重组质粒的鉴定；(6)病毒滴度测定；(7)干细胞培养；(8)病毒感染干细胞；(9)转基因干细胞鉴定；(10)转基因干细胞的目的蛋白含量测定；(11)转基因干细胞生物活性检测。本发明构建的转基因胚胎神经干细胞不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且还保留了原来的神经干细胞的特性。本发明不仅对运动神经元损伤性疾病，也对神经元变性性疾病的具有很好的治疗作用。
文档编号G01N33/68GK103215225SQ20121001628
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者孙勇 申请人:孙勇