存在lif时的神经干细胞扩增的制作方法

专利名称：存在lif时的神经干细胞扩增的制作方法
存在LIF时的神经干细胞扩增
背景技术：
在给定时间在给定组织中具有最广阔发展潜能的干细胞是自我更 新的多能祖细胞(multipotent progenitors) (Morrison等，1997 Cell 88:287-298)。最近，神经系统中的干细胞研究已经吸引了许多关注， 不仅由于它们对于理解神经发育的重要性，还由于它们在神经退行性 疾病治疗中的治疗潜能。
在中枢神经系统"CNS"的发育过程中，多能前体细胞(也称作 神经干细胞)增殖，产生暂时分裂的细胞，它们最终分化成构成成人 大脑的细胞类型。干细胞(来自其它组织)传统上被定义为具有自我 更新的能力(也就是形成更多干细胞)、具有增殖能力、和具有分化成 多种不同表型谱系(lineages)的能力。在神经干细胞的情况下，这包 括神经元、星形细胞和少突胶质细胞。例如，Potten和Loeffler (1990， Development 110:1001-20)将干细胞定性为能够增殖、自我维持、产生 大量分化的功能产物(progeny)并在受伤后使组织更生的未分化细胞。
已经从数种哺乳动物物种中分离出神经干细胞(NSCs)，包括小鼠、 大鼠、猪和人类(WO 93/01275、 WO 94/09119、 WO 94/10292、 WO 94/16718; Cattaneo等，1996， Mol. Brain Res. 42:161-66)。人类CNS 神经干细胞，与它们的啮齿动物同系物类似，在保持在含促细胞分裂 剂(通常是表皮生长因子(EGF)或EGF加上碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF))且不含血清的培养基中时，在悬浮培养中生长以形成被称 作"神经球"的细胞聚集体。已经观察到，人类神经干细胞具有大约 30天的倍增(doubling)速率(Cattaneo等，1996， Mol Brain Res.在FGF和EGF存在下7-14天的倍增 时间(Vescovi等，1999 Brain Pathol. 9:569-98)。在去除促细胞分裂剂 时，干细胞可以分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。
为了改进人类胎儿大脑干细胞的生长速率，过去十年期间许多不 同的研究人员已经使用了数种不同的方法和生长因子。已经证实，对 于人类胎儿神经干细胞(hNSCs)的扩增和维持，需要碱性成纤维细胞 生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。这些人类NSC培养基通 常以自由浮动细胞群(神经球)的形式生长，但是在仅存在bFGF和 EGF的情况下，神经球不能无限增殖。白血病抑制因子(LIF)的添加 表明通过将倍增时间降至7天(Carpenter等，1999， Exp. Neurol. 158:265-278)和4.5天(Wright等，2003 ， J. N画chem. 86:179-795) 来提高NSCs的增殖。
人类胎儿大脑干细胞被认为是用于受损组织再生的干细胞移植的 有吸引力的候选物(attractivecandidates)。在遗传全异个体之间的细胞 移植总是与宿主的移植排异相连。几乎所有细胞都表达主要组织相容 性复合体，MHC I类分子。此外，在暴露在促炎细胞因子中时，可以 诱使许多细胞类型表达MHC II类分子。同种异体移植物的排异主要是 以CD4和CD8子类的T细胞为中介的(Rosenberg等，1992 Annu. Rev. Immunol. 10:333)。同种异型反应性CD4 T细胞产生了加剧对同种异型 抗原的细胞溶解性CD8响应的细胞因子。在这些子类中，细胞的竞争 性亚种群(competing subpopulations)在抗原刺激之后发展，它们以其 产生的细胞因子为特征。产生IL-2禾n IFN-7的Thl细胞主要参与了同 种异体移植物排异(Mossmann等，1989 Annu. Rev. Immunol. 7:145)。 产生IL-4和IL-10的Th2细胞可以通过IL-10下调Thl响应(Fiorentino 等，1989 J. Exp. Med. 170:2081)。实际上，已经花费了大量努力以将不 合意的Thl响应转向Th2途径。对患者体内移植的不合意的同种异型反应性T细胞响应通常用免疫抑制药物(例如泼尼松、咪唑硫嘌呤和 环孢霉素A)处理。不幸地，这些药物通常需要患者一生服用并且它 们具有多种危险的副作用，包括全身性的免疫抑制。
神经干细胞已经显示表达了低或可忽略量的MHC I类和域II类抗
原(McLaren等，2001 J. Neuroimmuno. 112:35)，且按照McLaren等培
养的细胞通常在植入同种异体受体后受到排异，除非使用免疫抑制药 物。在受到IFN类的促炎细胞因子作用后，在细胞膜上上调 (up-regulate) 了MHC分子，此后会引发排异。
仍然需要提高神经干细胞培养物的增殖速率。还需要提高分化的 细胞群中神经元的数量。进一步需要改进神经干细胞移植物在植入宿 主时的存活力。因此，强烈需要用于使NSCs的增殖和多向分化潜能最 大化的培养条件标准化方法。本发明满足了这一需求。

发明内容
本发明包括用于在涂布表面上培养神经干细胞(NSC)以便在不 损失分化能力的情况下提高增殖速率的组合物和方法。
本发明包括包含体外贴壁培养物(其含有NSC)的组合物，其中 NSC细胞在存在LIF的情况下增殖，同时保持NSC的多向分化潜能。
一方面，NSC粘附到用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布的表面上。
另一方面，NSC来自人类。
再一方面，已经在NSC中引入外源性遗传物质。
本发明还包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法。
一方面，本方法包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细 胞群的形式培养NSC。
另一方面，本发明包括在用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布的表面上培 养NSC。再一方面，本发明包括培养人类NSC。 在又一方面，已经在NSC中引入外源性遗传物质。
本发明包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法，该方法 包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养NSC， 其中通过该方法调节所述NSC中MHC II类分子的表达。
本发明还包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法，其中 当与在持续存在LIF的情况下培养的其它方面相同的NSC相比，所述 NSC中MHC II类分子的表达降低。
一方面，该方法包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细 胞群的形式培养NSC—段时间，然后从培养物中去除LIF，并在不存 在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养所述NSC —段 时间。
另一方面，将NSCs在存在LIF的情况下培养大约7天。 再一方面，将NSCs在不存在LIF的情况下培养大约7天。 在又一方面，将NSCs在存在LIF的情况下培养一段时间，然后在
不存在LIF的情况下培养一段时间之后，NSCs表现出大约28-36小时
的倍增速率。
本发明包括通过下述方法制成的NSC——该方法是在存在LIF 的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养所述NSC —段时间， 然后从培养物中去除LIF，并在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴 壁细胞群的形式培养所述NSC —段时间。
一方面，NSC表现出大约28-36小时的倍增速率。 另 一方面，与在持续存在LIF的情况下培养的其它方面相同的NSC 上的MHC II类分子表达量相比，NSC表现出降低的MHC II类分子表
再一方面，NSC来自人类。在又一方面，已经在NSC中引入外源性遗传物质。 本发明包括治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的人类患者 的方法。
一方面，本发明包括获得分离的NSC、在存在LIF的情况下在涂 布表面上以贴壁细胞群的形式培养NSC —段时间、从培养物中去除 LIF、在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养 NSC —段时间和将该培养的NSC施用于有需要的患者。
另一方面，中枢神经系统的疾病、紊乱或病症选自遗传疾病、脑 外伤、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏症、帕金森症、脊髓损伤、中 风、多发性硬化、癌症、CNS溶酶体贮积症和头部外伤、癫痫。
再一方面，疾病、紊乱或病症是对中枢神经系统的组织或细胞的 损伤。
在又一方面，疾病、紊乱或病症是脑瘤。
一方面，施用到中枢神经系统上的培养的NSCs仍然在中枢神经系 统中存在和/或复制。
在又一方面，在对有需要的患者施用NSC之前，在分化培养基中 体外培养NSC。
在再一方面，在对有需要的患者施用NSC之前，对NSC进行基 因改性。
本发明包括包含分离的NSC和生物相容格栅(lattice)的组合物。 一方面，在存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细胞群的 形式培养NSC —段时间并在不存在LIF的情况下培养一段时间。 另一方面，格栅包括聚合材料。
再一方面，聚合材料是由聚合物纤维以网状或海绵状构成的。 又一方面，聚合材料包括选自乙醇酸、乳酸、富马酸丙酯、己内酯、玻尿酸(hyaluronan)、透明质酸和它们的结合物的单体。
另一方面，聚合材料包括蛋白质、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、
聚酐、聚磷腈、合成聚合物或它们的结合物。
在又一方面，聚合材料是通过其中分散有细胞的聚合物悬浮液的
交联形成的水凝胶。
一方面，迸一步用聚鸟氨酸涂布生物相容格栅。 另一方面，进一步用纤连蛋白涂布生物相容格栅。 再一方面，进一步用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布生物相容格栅。 本发明包括神经干细胞(NSC)的多向分化潜能的体外扩增和维
持方法，该方法包括在存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细
胞群的形式培养NSC —段时间并在不存在LIF的情况下培养一段时间。
一方面，进一步用聚鸟氨酸涂布生物相容格栅。 另一方面，进一步用纤连蛋白涂布生物相容格栅。 再一方面，进一步用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布生物相容格栅。


为了阐述本发明，在附图中描绘了本发明的某些具体实施方案。 然而，本发明不限于附图所描绘的具体实施方案的确切构造和工具。
图1，包括图1A至1D，是描绘未分化的人类神经干细胞培养物 的一系列图像。图1A描绘了在不存在白血病抑制因子(LIF)的情况 下培养的THD-hWB-015细胞。图1B描绘了在存在LIF的情况下培养 的THD-hWB-015细胞。图1C和1D分别描绘了在存在(图1D)和不 存在(1C) LIF的情况下培养的THD-hFB-17细胞。在所有情况下， NSCs在涂布盘上生长。
图2，包括图2A和2B，是描绘在不存在和存在hLIF的情况下培养的NSCS的一组图。将相同培养物在存在或不存在人类白血病抑制因
子(hLIF)的情况下在EGF+bFGF中维持200天以上。在不存在LIF 的情况下生长的培养物表现出远低于在存在LIF的情况下生长的细胞 的扩增速率。图2A描绘了THD-hWB-015细胞的生长曲线，图2B描 绘了 THD-hFB-017细胞的生长曲线。当在涂布盘上生长时，在存在LIF 的情况下THD-hWB-015的倍增时间为24-28小时，而在不存在LIF的 情况下是70-74小时。在存在LIF的情况下THD-hFB-017的倍增时间 为40-43小时，而在不存在LIF的情况下是90-94小时。
图3，包括图3A至图3D，是描绘在未分化的NSCs中并入的BrdU 的一系列图像。在不存在(图3A和3C)和存在(图3B和3D) hLIF 的情况下在两种不同培养物中检测BrdU并入。BrdU在细胞中的并入 代表了有效增殖。将细胞覆盖在在完全培养基+/-1111 中的涂布室玻片 上。在固定细胞之前，添加20juMBrdU24小时，随后用抗BrdU抗体 和与Alexa488配合的二级抗体将细胞染色。在不存在LIF的情况下， 平均有20-30%呈BrdU阳性的细胞，而在存在LIF的情况下有70-75% 对BrdU呈阳性的细胞。图3A和3B描绘了在存在(图3B)和不存在
(图3A) LIF的情况下的THD-hWB-015细胞。图3C和3D描绘了在 存在(图3D)和不存在(图3C) LIF的情况下的THD-hFB-17细胞。 图4，包括图4A至图4D，是描绘覆盖在涂布室玻片上的未分化 细胞中的巢蛋白表达(识别未分化NSCs的标记物)的一系列图像。图 4A和4B描绘了在存在(图4B)和不存在(图4A) LIF的情况下的 THD-hWB-015细胞。图4C和4D描绘了在存在(图4D)和不存在(图 4C) LIF的情况下的THD-hFB-17细胞。在每种情况下，94-99%的细 胞是巢蛋白阳性的。在图4A (无LIF的THD-hWB-015)中，86%的 细胞仅对巢蛋白呈阳性，8-10%的细胞对巢蛋白和胶质原纤维酸性蛋白
(GFAP是星形细胞的标记物)呈阳性，且3-4%的细胞仅对GFAP呈阳性。在图4B (含LIF)中，98。/。的细胞对GFAP和巢蛋白都呈阳性， 而仅有1-2%的细胞是仅对GFAP呈阳性的。
图5，包括图5A至5D，是描绘在存在或不存在hLIF的情况下生 长的人类NSC培养物(THD-hWB-015和THD-hFB-017)的体外分化 的一系列图像。图5B和5D表明hLIF在培养基中的存在不会影响这 些培养物的多潜能性。如本文其它地方所述使培养物分化14天。
图6，包括图6A至6H，是描绘在补充了 bFGF和EGF的培养基 中培养14天后的NSCs表型(名为THD-hWB-015 (P13)的NSC系 列)的一系列FACS分析图。图6A至6H分别描绘了CD45、 CD86、 CD14、 CD133、 CD80、 CD34、 MHC II类分子和MHC I类分子的图。
图7，包括图7A至7H，是描绘在补充了 bFGF、 EGF和LIF的培 养基中培养14天后的NSCs表型(名为THD-hWB-015 (P13)的NSC 系列)的一系列FACS分析图。图7A至7H分别描绘了 CD45、 CD86、 CD14、 CD133、 CD80、 CD34、 MHC II类分子和MHC I类分子的图。
图8，包括图8A至8H，是描绘在补充了 bFGF、 EGF和LIF的培 养基中培养7天，然后在其它方面相同的补充了 bFGF和EGF但是不 存在LIF的培养基中培养后的NSCs表型(名为THD-hWB-015 (P13) 的NSC系列)的一系列FACS分析图。图8A至8H分别描绘了 CD45、 CD86、 CD14、 CD133、 CD80、 CD34、 MHC II类分子和MHC I类分 子的图。
图9，包括图9A至9D，是描绘在如下四种生长条件下培养后的 NSCs表型(名为THD-hWB-015的NSC系列)的一系列FACS分析图 未涂布的烧瓶(图9A);未涂布的烧瓶，存在LIF(图9B);涂布烧瓶 (图9C);和涂布烧瓶，存在LIF (图9D)。对于每种生长条件，分别 分析培养细胞的CD45、 CD184、 CD117和CD133表达。
具体实施例方式
在现有技术方法中，通常在存在生长因子，例如碱性成纤维细胞
生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)之类生长因子的情况下以 自由浮动的细胞群(神经球)形式培养NSCs。按照本发明的方法，以 贴壁细胞群的形式培养NSCs。优选地，在涂布表面上生长贴壁培养物， 更优选地，在培养基中补充白血病抑制因子(LIF)。本领域技术人员 可以根据本公开认识到，可以用细胞外基质组分涂布该表面。细胞外 基质组分可以包括但不限于，聚鸟氨酸和/或纤连蛋白。优选地，细胞 外基质组分是牛纤连蛋白或猪纤连蛋白。更优选地，细胞外基质组分 是人纤连蛋白。此外本领域技术人员可以认识到，可以使用本领域已 知的其它生长因子增强NSCs的增殖。
本发明包括在保持其多向分化潜能的同时诱导或提高神经干细胞 (NSCs)增殖的方法和组合物。本发明还涉及下述发现——按照本文 公开的方法培养NSCs，可以调节NSCs的MHC分子表达。本文公开 的内容表明，与使用本领域已知的标准方法培养的NSC的MHC分子 表达相比，除了在保持它们的多向分化潜能的同时提高了 NSCs的增 殖，在LIF存在下作为贴壁细胞群培养NSCs还调节了 NSCs的MHC 分子表达的上调和/或诱发。也就是说，本发明提供了以下述方式培养 NSCs的方法——其提供了优于在培养物中提高NSCs增殖所用的标准 方法的额外益处，因为可以控制受体中这些细胞的排异基础。
本发明还涉及下述发现——通过LIF调节NSC进行的主要组织相 容性复合体II类(MHCn类)分子的表达。也就是说，使用本发明的 培养方法，例如在存在LIF的情况下使NSCs作为贴壁细胞群生长，可 以调节NSCs的MHC II类分子表达。
在本发明的进一步具体实施方案中，可以使用下述方法调节NSCs 的MHC II分子表达——该方法包括使NSCs在存在LIF的情况下生长一段时间，然后使NSCs在不存在LIF的情况下生长一段时间。在优选 方法中，使细胞在存在LIF的情况下生长大约7天，随后在不存在LIF 的情况下再生长大约7天。
在本发明的进一步具体实施方案中，与仅在存在LIF的情况下使 NSCs生长相比，使用下述方法可以降低NSCs的MHC II类分子表达 ——该方法包括使NSCs在存在LIF的情况下生长一段时间，然后使 NSCs在不存在LIF的情况下生长一段时间。在优选方法中，使细胞在 存在LIF的情况下生长大约7天，随后在不存在LIF的情况下再生长 大约7天。
此处使用的本发明的NSC培养/扩增方法是指提高NSCs增殖的方 法。优选地，提高NSCs增殖的方法包括在存在LIF的情况下培养NSCs 的贴壁细胞群，其中NSCs保持了它们的多向分化潜能(它们分化成多 种细胞类型之一例如神经元、星形细胞、少突细胞和类似细胞的能力)。
在本发明的进一步具体实施方案中，与使用现有技术方法扩增或 培养的NSCs相比，使用本发明的方法扩增的NSCs保持了它们更大程 度(也就是以更大比例)分化成神经元的能力。
此处所述的NSC培养/扩增方法解决了用作人类疾病治疗方法的 NSCs生长的主要问题。也就是说，在本文公开的内容之前，NSCs难 以在培养基中分离并扩增(也就是说，难以为治疗用途诱使它们足量 增殖)。本文公开的内容证实，可以为治疗用途大量生长和分离NSCs， 并且这使本发明有别于现有技术公开的内容。
本发明的神经干细胞可以在贴壁培养物中增殖。当本发明的神经 干细胞增殖时，可以使用巢蛋白抗体作标记物以识别未分化细胞并将 它们与分化细胞区别开。
当本发明的细胞分化时，多数细胞失去它们的巢蛋白阳性免疫反 应性。此外，可以使用各种神经元或神经胶质蛋白的特异性抗体确定分化细胞的表型性质。可以使用神经元特异性神经丝、Tau、 ^-微管蛋 白的抗体或其它已知神经元标记物识别神经元。可以使用胶质原纤维 酸性蛋白"GFAP"的抗体或其它已知星形细胞标记物识别星形细胞。 可以使用半乳糖脑苷脂、04、髓磷脂碱性蛋白"MBP"的抗体或其它 已知少突细胞标记物识别少突细胞。可以通过用抗体(例如M2抗体) 或其它已知神经胶质标记物染色来识别神经胶质细胞。
定义
此处使用的下列术语各自具有在该节中与其相关的含义。
冠词"一个"和"一种"在此是指一种或一种以上(也就是至少
一种)该冠词的语法对象。作为例子，"一种元素"是指一种或一种以
上元素。
术语"大约"可以被本领域普通技术人员理解，并且在其所用情 境下在一定程度上变化。
"同种异体"是指来自相同种类的不同动物的移植物。此处使用 的术语"自体的"是指来自将其再引入的相同个体的任何材料。
此处使用的术语"生物相容格栅"是指有利于制成有益组织生长 的三维结构的基材。因此，例如，可以将细胞培养或种到这种生物相 容格栅上，例如包含细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长 因子等的生物相容格栅。该格栅可以模制成有利于组织类型生长的所 需形状。此外，至少在细胞培养过程的早期阶段，在培养基和/或基材 中补充有利于合适组织类型和结构生长的因子(也就是生长因子、细 胞因子、细胞外基质材料等等)。
此处使用的"中枢神经系统"应该被认为包括哺乳动物的大脑和/ 或脊髓。该术语在一些情况下还可以包括眼睛和视神经。
此处使用的术语"涂布"是指已经用细胞外组分处理过的表面。细胞的表面。细胞外组分的例子包括，
但不限于，纤连蛋白、层粘连蛋白、聚-D-赖氨酸和聚-L-赖氨酸。
此处使用的术语"中枢神经系统的疾病、紊乱或病症"是指由中 枢神经系统的细胞表达的基因中的基因突变引起的疾病、紊乱或病症， 从而通过中枢神经系统的异常结构和/或功能(例如神经退行性疾病或 原发肿瘤形成)表明这种突变的影响之一。这种基因缺陷可以是中枢 神经系统的细胞中突变的、无功能的或表达不足的基因的结果。该术 语还应该被认为包括中枢神经系统中的其它病变，它们不是中枢神经 系统的细胞本身的基因缺陷的结果，而是中枢神经系统被非起源于中 枢神经系统的细胞浸入的结果，例如在中枢神经系统中的转移性肿瘤 形成。该术语应该被认为包括由中枢神经系统的组织的直接损伤引起 的中枢神经系统外伤。
此处使用的"分化"是指已经达到成熟的终点状态的细胞，这样 细胞己经完全生成并表现出对特定环境和/或功能的生物专化。通常， 分化细胞的特征在于，在该细胞中编码分化相关蛋白的基因的表达。 例如，在神经胶质细胞中髓磷脂蛋白的表达和髓鞘的形成是最终分化 的神经胶质细胞的典型例子。当细胞被称作"分化中"时，如该术语 在此使用的那样，该细胞正在被分化的过程中。
此处使用的"分化培养基"是指包含添加剂或不含添加剂的细胞
培养基，从而使没有完全分化的干细胞、胚胎干细胞、ES类细胞、神 经球、NSC或其它这样的祖细胞当在培养基中培养时，发展成具有分 化细胞的一些或所有特性的细胞。
此处使用的"可扩增性"是指细胞增殖，例如大量扩增，或在细 胞群的情况下进行群体倍增的能力。
"移植物"是指用于移植的细胞、组织、器官或其它任何生物相 容格栅。此处使用的术语"培养基"是指促进细胞生长的培养基。培养基 通常包含动物血清。在一些情况下，培养基可以不含动物血清，但是 可以含有促细胞分裂剂。
此处使用的"白血病抑制因子"(LIF)是指具有多种生物功能的
白细胞介素-6细胞因子类的22kDa蛋白成员。LIF已经证实具有在白 血病细胞中诱发终末分化、在正常和脊髓白血病细胞中诱发终末分化 并在肝细胞中激发急性期蛋白质合成的能力。LIF还已经在此表明，在 保持NSCs的多向分化潜能的同时，提高了 NSCs在未分化态下的增殖。 此处使用的术语"LIF+A方法"是指使细胞在存在LIF的情况下生 长一段时间，然后将细胞在不存在LIF的情况下再培养一段时间的培 养方法。
此处使用的术语"调节"是指生物态的任何改变，也就是提高、 降低和类似情况。
此处使用的"调节MHC类分子表达"是指细胞表达出的MHC类 分子表达的任何改变。根据本文公开的内容，据观察，通过LIF精密 调节NSCs的MHCII类分子表达。在存在LIF的情况下，在NSCs上 表达MHC II类分子。还观察到，当按照使细胞在存在LIF的情况下生 长一段时间然后使细胞在不存在LIF的情况下再生长一段时间的方法 使细胞生长时，与在存在LIF的情况下生长一段时间的细胞中的MHC II类分子表达相比，降低了 NSCs的MHC II类分子表达。
此处使用的术语"多能的"和"多向分化潜能"是指中枢神经系 统的干细胞分化成一种以上细胞类型的能力。例如，中枢神经系统的 多能干细胞能够分化成细胞，包括但不限于神经元、星形细胞和少突 细胞。
此处使用的"神经球"是指神经干细胞/祖细胞，其中可以通过用 于检测细胞中的巢蛋白的免疫染色法检测巢蛋白表达。神经球是增殖球的形成是神经干细胞在体外培养 中的特征。
此处使用的"神经干细胞"是指未分化的、多能的、自我更新的 神经细胞。神经干细胞是能够分化并在合适条件下具有自我更新能力 并可以最终分化成神经元、星形细胞和少突细胞的克隆源性多能干细
胞。因此，神经干细胞是"多能的"，因为干细胞后代(progeny)具有 多种分化途径。神经干细胞能够自稳定，这意味着随着每次细胞分化， 平均来说一个子细胞也是一个干细胞。
此处使用的"神经细胞"是指表现出与来自中枢神经系统和/或外 周神经系统的神经胶质细胞和神经元类似的形态、功能和表型特性的 细胞，
此处使用"神经元类细胞"是指表现出与神经元类似的形态并可 检测地表达神经元特异性标记物(例如，但不限于，MAP2、神经丝 200kDa、神经丝-L、神经丝-M、突触素、/3-微管蛋白III (TUJ1)、 Tau、 NeuN、神经丝蛋白和突触蛋白)的细胞。
此处使用的"星形细胞类细胞"是指表现出与星形细胞类似的表 型并表达星形细胞特异性标记物(例如但不限于GFAP)的细胞。
此处使用的"少突细胞类细胞"是指表现出与少突细胞类似的表 型并表达少突细胞特异性标记物(例如但不限于0-4)的细胞。
此处使用的"细胞周期的进展(progression)"是指细胞准备和/或 进入有丝分裂和/或减数分裂的过程。细胞周期的进展包括通过Gl阶 段、S阶段、G2阶段和M-阶段的进展。
此处使用的"增殖"是指类似形式尤其是细胞的类似形式的再生 或复制。也就是说，增殖包括产生更大量的细胞，并且可以尤其通过 简单计算细胞数量、测量引入细胞的311-胸苷，和类似情况来进行测量。 "移植物"是指待移植的生物相容格栅或给体组织、器官或细胞。此处使用的"治疗有效量"是足以为被施加细胞的对象提供有益 作用的细胞量。
"异种"是指来自不同类型的动物的移植物。
此处使用的"基本纯化的"细胞是基本不含其它细胞类型的细胞。 因此，基本纯化的细胞是指已经与其它细胞类型(在天然生成的状态 下它们通常与该细胞相关)分离的细胞。此处使用的术语"外源的" 是指从有机体、细胞或系统外部引入或产生的任何材料。
"编码"是指多核苷酸(例如基因、cDNA、或mRNA)中核苷酸 的特异序列(其充当具有指定核苷酸序列(也就是rRNA、 tRNA和 mRNA)或指定氨基酸序列的生物过程中其它聚合物和大分子合成的 模板)的固有性质和由其产生的生物性质。因此，如果与一基因对应 的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中制造蛋白质，则该基 因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并通常提供在序列表 中的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可用于编码 蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
除非另行说明，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括作为彼此的 同义(degenerate)形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。 编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
"分离的核酸"是指己经与在天然生成的状态下在其侧面的序列 分离的核酸链段或片段，也就是已经与通常与该片段相邻的序列(也 就是在天然生成的基因组中与该片段相邻的序列)分离的DNA片段。 该术语该适用于已经基本从其它组成(这些组分天然与核酸相伴，也 就是RNA或DNA或蛋白质，它们在细胞中天然与核酸相伴)中提纯 出来的核酸。该术语因此包括，例如，并入载体中、并入自主复制质 粒或病毒中、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中、或作为独 立于其它序列的分离分子(也就是作为通过PCR或限制酶切割产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。其还包括作为编码 附加多肽序列的混杂(hybrid)基因的一部分的重组DNA。
在本发明中，使用通常产生的核酸的下列縮写。"A"是指腺苷， "C"是指胞嘧啶，"G"是指鸟苷，"T"是指胸苷，且"U"是指尿苷。
此处使用的术语"在转录控制下"或"有效连接(operatively linked )" 是指促进子相对于多核苷酸位于正确的位置和朝向以控制多核苷酸的 RNA聚合酶引发和表达。
此处使用的术语"促进子/调节序列"是指可切实地与促进子/调节 序列连接的基因产品的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列 可以是中心促进子序列，在其它情况下，该序列还可以包括增强子序 列和基因产品表达所需的其它调节元件。促进子/调节序列可以是，例 如，以组织特异性方式表达基因产品的序列。
"组成型"启动子是，当可切实地与编码或指定基因产品的多核 苷酸连接时，在细胞的多数或所有生理条件下在细胞中产生基因产品 的核苷酸序列。
"可诱导的"启动子是，当可切实地与编码或指定基因产品的多 核苷酸连接时，仅在细胞中存在与该启动子相对应的诱导物时才产生 基因产品的核苷酸序列。
"组织特异性"促进子是当可切实地与编码或指定基因产品的多 核苷酸连接时，仅在该细胞是具有与促进子相对应的组织类型的细胞 时才产生基因产品的核苷酸序列。
"载体"是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸输送到细胞 内部的组合物。本领域已知多种核酸，包括但不限于，线性多核苷酸、 与离子型或良性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语"载 体"包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应该被认为包括有利于将 核酸转移到细胞内的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体、和类似物。病毒载体的例子包括，但不限于，腺病毒载体、 腺联病毒载体、逆转录病毒载体和类似物。
"表达载体"是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包 含可切实地与待表达的核苷酸序列连接的表达控制序列。表达载体包 含充足的用于表达的顺式作用元件；可以通过宿主细胞或在体外表达 系统中提供用于表达的其它元件。表达载体包括本领域己知的所有载 体，例如包含重组多核苷酸的粘粒、质粒(也就是裸露的，或包含在 脂质体中)和病毒。
描述
本发明包括在保持NSCs的多向分化潜能的同时提高增殖的方法。 优选地，NSCs来自哺乳动物，更优选地，NSCs来自人类。该方法包 括使用本领域公知的方法分离NSCs，并以贴壁培养的形式在涂布表面 上培养NSCs，其扩增到贴壁和/或非贴壁神经球培养物中。优选地，在 存在LIF的情况下以贴壁培养的形式培养分离的NSCs。更优选地，在 存在LIF的情况下，分离的NSCs以贴壁培养的形式培养并扩增到贴壁 培养物中。
本发明涉及下述发现——通过在存在LIF的情况下使NSCs作为贴 壁细胞群生长，可以提高NSCs的扩增(NSCs多次自我复制的能力)。 在本发明的进一步具体实施方案中，在存在LIF的情况下在涂布表面 上培养NSC贴壁细胞群以便在不损失分化能力的情况下提高它们的增 殖速率。
本发明还涉及下述发现——按照本文公开的方法培养NSCs，可以 调节NSCs的MHC分子表达。本文公开的内容表明，与使用本领域已 知的标准方法培养的NSCs的MHC分子表达相比，除了在保持多向分 化潜能的同时提高NSCs的增殖，在存在LIF的情况下作为贴壁细胞群培养NSCs还调节了 NSCs的MHC分子表达的上调和/或诱发。如此， 本发明提供了一种以下述方式培养NSCs的方法——其提供了优于在 培养物中提高NSCs增殖用的标准方法的额外益处。
NSCs的分离
NSCs可以获自哺乳动物，优选人类的中枢神经系统。这些细胞可 以获自各种组织，包括，但不限于大脑、后脑、全脑和脊髓。可以使 用本文其它地方详述的方法或使用本领域已知的方法，例如使用美国 专利5,958，767(完全经此弓i用并入本文)，分离和培养NSCs。用于NSCs 分离的其它方法是本领域公知的，并且容易由技术人员使用，包括未 来开发出的方法。例如，已经从数种哺乳动物物种，包括小鼠、大鼠、 猪和人类中分离出NSCs。参看，也就是，WO 93/01275、 WO 94/09119、 WO 94/10292、 WO 94/16718和Cattaneo等(1996 Mol. Brain Res. 42:161-66)，这些均经此引用并入本文。本发明决不限于这些或任何其 它获得相关细胞的方法。
可以使用任何合适的组织来源以产生本发明的NSCs。可以通过在 悬浮液中或在贴壁基材上培养细胞来诱导NSCs增殖和分化。参看，也 就是，美国专利5,750,376和美国专利5,753,506 (均完全经此引用并入 本文)，和其中所述的培养基。同种异体移植物和自体移植物均被考虑 用于移植用途。
NSCs可以通过各个细胞与相连的组织细胞外基质的离解从许多 不同类型的组织，例如从给体组织中分离出，或来自商业NSCs来源。 在一个例子中，使用无菌程序去除来自大脑的组织，并使用本领域已 知的任何方法离解细胞，包括用胰蛋白酶、胶原酶之类的酶处理，或 使用物理离解法，例如用钝器切碎或处理。可以在无菌组织培养基中 进行神经细胞和其它多能干细胞的离解。将离解后的细胞低速(200至2000 rpm之间，通常400至800 rpm之间)离心，抽吸悬浮培养基， 然后使这些细胞再悬浮再培养基中。
NSCs的处理
本发明包括处理NSCs以便在不损失其分化能力的情况下提高其 增殖速率的方法和组合物。尽管不希望受制于任何特定理论，在2-维 或3-维生物相容格栅中用补充了 LIF的指定培养基处理NSCs被认为 在保持了 NSCs的多向分化潜能的同时提高了 NSCs的增殖速率。
在本发明的一个具体实施方案中，在用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布 的表面上培养细胞。然而，本发明不应该被认为仅包括只在这些化合 物上培养细胞。相反，本发明应该包括可用于以贴壁培养的形式培养 NSCs的生物相容材料。
本发明还包括在2-维和3-维生物相容格栅中在指定培养基中培养 NSCs。生物相容格栅的使用通过支持和/或引向植入细胞的死亡(fate) 来在体内促进组织工程技术。例如，本发明可以通过在适合它们扩增 的条件培养本发明的NSCs来促进脑组织再生并分化以形成所需结构。 在一些应用中，这通过将它们转移到动物体内(通常在需要这种新物 质的位置)来实现。
在另一具体实施方案中，可以在体外诱导细胞分化并扩增成所需 组织。在这种应用中，在有利于形成对组织生长有益的三维结构的基 材上培养细胞。因此，例如，可以将细胞培养或种到生物相容格栅上， 例如包含细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子和类似 物的生物相容格栅。该格栅可以模制成有利于组织类型生长的所需形 状。此外，至少在这种培养过程的早期阶段，在培养基和/或基材中补 充有利于合适组织类型和结构生长的因子(也就是生长因子、细胞因 子、细胞外基质材料和类似物)。实际上，在一些具体实施方案中，需要与各个组织类型的成熟细胞、或其前体共同培养细胞，或如文中所 述使细胞暴露在各自的培养基中。
为了有利于使用本发明的NSC制造这种组织，本发明提供了包含 本发明的细胞(和细胞群)和生物相容格栅的组合物。通常，格栅是
由聚合材料制成的，具有网格或海绵状的纤维，通常间距约为大约100 微米至大约300微米。这种结构提供了足够让细胞在其上生长和增殖 的面积。优选地，该格栅可以随时间生物降解，这样其可以在生长时 吸收到动物有机物质中。因此，合适的聚合格栅可以由乙醇酸、乳酸、 富马酸丙酯、己内酯、玻尿酸、透明质酸之类的单体构成。其它格栅 可以包括蛋白质、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈或合成 聚合物(特别是可生物降解的聚合物)。当然，用于形成这种格栅的合 适聚合物可以包括一种以上的单体(也就是所述单体的结合)。此外， 格栅也可以根据需要包括激素，例如生长因子、细胞因子和成形素(也 就是视黄酸、aracadonic acid和类似物)、所需细胞外基质分子(也就 是聚鸟氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原和类似物)或其它材料(也 就是DNA、病毒、其它细胞类型和类似物)。
在另一具体实施方案中，本发明提供了包含本发明的NSCs和具有 其所需表型的成熟/分化细胞的格栅组合物，特别是用于诱导本发明的 NSCs适当地在该格栅中分化(也就是在格栅中共同培养这些细胞的作 用)。
不希望受制于任何特定理论，作为贴壁细胞群培养细胞的一个益 处在于，与使细胞作为被称作神经球的自由浮动的细胞群生长时可能 的情况相比，获得更均匀的细胞群。此外，贴壁细胞群提供了使细胞 群更均匀地接触培养基中存在的因子(也就是生长因子、营养因子和 类似物)的途径。
在本发明的另一具体实施方案中，在存在LIF的情况下在涂布表面上作为贴壁细胞群培养的细胞据观察在不损失其分化成包括但不限 于神经元、星形细胞和少突细胞在内的细胞类型的能力的情况下具有 提高的增殖速率。细胞增殖速率提高了至少大约3倍，且细胞未丧失 其分化能力。优选地，当按照本发明的方法培养时，细胞增殖速率提
高了至少大约7倍，更优选至少大约10倍，再优选至少大约15倍， 最优选至少大约30倍，其中细胞未丧失它们的分化能力。
在本发明的再一方面，当在存在LIF的情况下在涂布表面上作为 贴壁细胞群培养时，细胞扩增了大约15-17倍。
在本发明的另一方面，当在不存在LIF的情况下在涂布表面上作 为贴壁细胞群培养时，细胞扩增了大约5-7倍。
在本发明的再一方面，当在存在LIF的情况下在未涂布表面上作 为贴壁细胞群培养时，细胞扩增了略高于大约5-7倍(也就是大约6-8 倍)。
在本发明的另一方面，当在不存在LIF的情况下在未涂布表面上 作为贴壁细胞群培养时，细胞扩增了大约3-5倍。
在本发明的另一方面，可以使用本文公开的方法调节NSC的倍增 时间。例如，在存在LIF的情况下在涂布表面上作为贴壁细胞群培养 的NSCs据观察具有大约20-24小时的倍增时间。在不存在LIF的情况 下培养的NSCs的倍增时间据观察为大约60小时。按照LIF+A方法(在 存在LIF的情况下生长一段时间，然后在不存在LIF的情况下生长一 段时间)培养的NSCs的倍增时间据观察为大约28-36小时。 一方面， 按照LIF+A方法培养的NSCs的倍增时间为大约30-36小时。另一方面， 按照LIF+A方法培养的NSCs的倍增时间为大约28-30小时。
本发明进一步提供了以提高的增殖速率(降低的倍增时间)诱发 NSCs的增殖的新型方法和培养基，其与使用本领域已知的方法产生的 细胞数相比，提供了更大数量的NSCs。本发明的用于NSCs增殖的培养基是指补充了 LIF的指定培养基。本发明的培养基可用于培养任何 NSCs，例如NSCs的短期和长期增殖，且NSCs可以来自任何来源， 包括但不限于小鼠、大鼠和人类。此外，可以使用本领域己知的技术 使NSCs和它们的分化潜能固定(immortalized)或有条件地固定。或 者，可以使用NSCs作为原始培养物，由此还没有以转化或固定NSCs 的方式培养细胞。
培养基
可用于培养NSCs的培养基包含LIF并且在用于培养贴壁NSC群 时明显且意外地提高了 NSCs的增殖速率，
当对在存在和不存在LIF的情况下培养的NSCs的生长速率进行比 较时，意外地，LIF在培养基中的存在据观察明显提高了被培养的 NSCs，特别是贴壁NSC培养物的细胞增殖速率。类似地，LIF在培养 基中的存在据观察明显降低了被培养的NSCs的倍增时间。
本发明的培养基包含有效量的下列可用于诱导NSCs增殖的组分:
(a) 标准培养基，其无血清(含有0-0.49%血清)或含很少血清 (含0.5-5.0%血清)，被称作基础培养基，例如Iscove，s改性的
Dulbecco，s培养基("IMDM"、 RPMI、 DMEM、 DMEM/F12、 Fischer，s、 a培养基、Leibovitz，s、 L-15、 NCTC、 F-IO、 F-12、 MEM和McCoy，s。
(b) 合适的碳水化合物，例如葡萄糖；
(c) 缓冲剂，例如MOPS、 HEPES或Tris，优选HEPES;
(d) —种或多种激发神经干细胞增殖的生长因子，例如EGF、 bFGF、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、和它 们的类似物、衍生物和/或结合物，优选EGF与bFGF的结合；和
(e) LIF。
标准培养基通常包含细胞存活所需的各种基本组分，包括无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、维生素和类似物。优选地，DMEM 或F-12是标准培养基，最优选为DMEM和F-12的50/50混合物。这 两种培养基均可通过商业途径获得(DMEM; GIBCO， Grand Island, NY; F陽12， GIBCO, Grand Island, NY) 。 DMEM/F-12的预混制剂也可通过商 业途径获得。为培养基提供附加的谷氨酰胺是有利的。在培养基中提 供肝素也是有利的。在培养基中加入碳酸氢钠是更有利的。加入N2补 充剂也是有利的。优选地，NSCs的培养条件应该尽可能接近生理条件。 培养基的pH值通常为6-8，优选大约7，最优选大约7.4。细胞通常在 30-40°C，优选32-38°C，最优选35-37'C培养。细胞优选在存在大约 5%(302的情况下生长。
本发明的培养基中存在的LIF的浓度优选为大约至少2纳克/毫升 至大约20纳克/毫升，优选至少大约4纳克/毫升至大约18纳克/毫升， 更优选至少大约6纳克/毫升至大约16纳克/毫升，再优选至少大约8 纳克/毫升至大约18纳克毫升，最优选至少大约10纳克/毫升至大约16 纳克/毫升。在本发明的一个方面，LIF的浓度为大约10纳克/毫升。
可以在补充了 LIF的培养基中将NSCs培养足以诱导NSCs的增强 的增殖的时间，同时保持它们的多向分化潜能。优选地，对NSC进行 下述处理方法——该方法包括在存在LIF的情况下以贴壁培养的形式 培养细胞一段时间直至细胞在转到另一涂布表面之前达到一定的群集 度。优选地，群集度为大于70%。更优选地，群集度大于90%。细胞 在本发明的培养基中培养的时间可以为适合细胞体外培养的任何时 间。根据本公开，本领域技术人员可以意识到，可以将NSCs在补充了 LIF的培养基中培养7天以上。例如，可以将NSCs培养大约一周，两 周、 一个月、两个月、六个月或甚至一年(当细胞群集时将它们转移); 且可以在培养过程中的任何时间改变培养基。
可以在整个培养过程中持续存在LIF的情况下培养NSCs。或者，可以在任何时间从培养基中去除LIF，并可以将NSC在不存在LIF的 情况下培养一段时间。在将细胞不存在LIF的情况下培养一段时间后， 可以再将LIF加入培养基中。这种培养方法被称作LIF+A方法。
LIF+A方法包括在存在LIF的情况下培养NSCs —段时间，然后在 不存在LIF的情况下再培养NSCs —段时间。在存在LIF的情况下培养 细胞的时间可以是适合细胞体外培养的任何时间。优选地，将细胞在 存在LIF的情况下培养大约7天。在存在LIF的情况下培养NSCs之后， 将细胞在不存在LIF的情况下培养一段时间。细胞在不存在LIF的情 况下培养的时间也可以是适合细胞体外培养的任何时间。优选地，NSCs 可以在不存在LIF的情况下培养大约7天。LIF+A方法可以重复一次、 两次、三次或产生所需细胞群所需的多次。可以按照LIF+A方法将NSCs 培养大约两周、 一个月、两个月、六个月、或甚至一年；并可以在处 理方法过程中的任何时间改变培养基。
在按照本文公开的方法培养NSCs之后，可以立即取出NSCs用于 实验/治疗用途，或者可以将它们冷藏供此后使用。
MHC调节
可以对本发明的方法使用来自任何来源的NSCs，也就是刚分离或 冷藏的那些以便在保持多向分化潜能的同时诱发NSCs的增强的增殖。
在本发明的一个具体实施方案中，通过按照本文所公开的方法培 养NSCs来调节NSCs中的MHC II类分子表达。根据本文公开的内容， 据观察，通过LIF精密调节NSCs的MHC II类分子表达。当在存在 LIF的情况下培养NSCs时，据观察在NSCs上存在MHC II类分子。 还观察到，当按照LIF+A方法培养细胞时，与其它方面相同的在存在 LIF的情况下培养的NSCs群的MHC II类分子表达相比，降低了 NSCs 的MHC II类分子表达。由此，本发明包括按照LIF+Z-方法培养NSCs以便在保持其多向分 化潜能并调节MHC类分子表达的同时诱发增强的增殖(降低倍增时 间)的方法。按照本文公开的方法由NSCs培养获得的细胞群也包括在 本发明中。例如，本发明包括包含已经按照LIF+A方法培养的NSCs 的细胞群。
不希望受制于任何特定理论，使用此处的方法产生的细胞群可用 于实验/治疗用途，因为与使用现有技术中己知的方法产生的细胞数相 比，可以在相同时间内获得更大量的细胞。此外，本发明的细胞群可 用，因为可以使用本发明的方法调节NSCs的MHC类分子表达。
表征
在存在LIF情况下的细胞培养过程中(或在不存在LIF的过程中 或在LIF+A方法过程中)的任何时间点，可以收取并收集细胞以立即 用于实验/治疗用途或冷藏供此后使用。在本发明的一个方面，在NSCs 培养过程中的任何步骤中冷藏细胞。冷藏是本领域中普通的程序并在 此包括目前用于冷藏细胞以供将来分析和使用的所有程序。在另一方 面，可以收取细胞并进行流式细胞术以评测细胞表面标记物以鉴于培 养条件评定细胞表型的变化。
可以使用本领域的多种方法和本文公开的方法中的任一种表征 NSCs细胞。这些细胞可以通过表面和细胞内蛋白、基因和/或其它标记 物的识别来表征——这些标记物表明细胞分化以使细胞表现出神经元 之类的细胞的至少一种特征。这些方法包括，但不限于，(a)通过细 胞表面蛋白(例如巢蛋白、MAP2、 GFAP、 DAKO、 04、 CD45、 CD86、 CD14、 CD133、 CD80、 CD34、 MHC II类分子和MHC I类分子)的免 疫荧光检定法(例如流式细胞术)或就地免疫染色进行的细胞表面蛋 白检测；通过使用特异性抗体的免疫荧光鉴定法(例如流式细胞术)或就地免疫染色法进行的细胞内蛋白检测；(C)通过聚合酶链反应、
就地杂交和/或其它印迹分析之类的方法进行的表达mRNAs的检测。
相关细胞的表型标记物是本领域普通技术人员公知的。持续公开 表型标记物或可以在不需过度实验的情况下识别。可以使用这些标记
物的任一种确认NSCs的分化阶段。谱系(lineage)特异性表型特征可 以包括细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞形态和分泌产物。
为了识别NSCs增殖或分化过程中的细胞表型，可以使用各种细胞 表面或细胞内标记物。当本发明的NSCs正在增殖时，可以使用巢蛋白 抗体作标记物以识别未分化的细胞。
当分化时，多数NSCs丧失了它们的巢蛋白阳性免疫反应性。特别 地，可以使用各种神经元或神经胶质蛋白的特异性抗体以识别分化 NSCs的表型性质。可以使用神经元特异性烯醇化酶("NSE")、神经 丝、tau、 /3-微管蛋白的抗体或其它已知神经元标记物识别神经元。可 以使用胶质原纤维酸性蛋白("GFAP")的抗体或其它已知星形细胞标 记物识别星形细胞。可以使用半乳糖脑苷脂、04、髓磷脂碱性蛋白 ("MBP")的抗体或其它已知少突细胞标记物识别少突细胞。
也可以通过识别特有的由这些表型生成的化合物来识别细胞表 型。例如，可以通过它们产生神经递质(例如乙酰胆碱、多巴胺、肾 上腺素、去甲肾上腺素和类似物)的能力来识别神经元。
可以按照这些神经元产生的特异性产物来识别特定神经元表型。 例如，可以通过谷氨酸脱羧酶("GAD")或GABA的产生来识别 GABA-ergic神经元。可以通过多巴脱羧酶("DDC")、多巴胺或酪氨 酸羟化酶("TH")的产生来识别多巴胺能的神经元。可以通过胆碱乙 酰基转移酶("ChAT")的产生来识别胆碱能神经元。可以通过用NeuN 染色来识别海马神经元。根据本公开，本领域技术人员可以认识到， 可以使用任何合适的用于识别特定神经元表型的已知标记物。本发明还包括按照本文提供的方法培养的细胞。在本发明的一个
方面，与由其它方面相同的在持续存在LIF的情况下培养的NSC产生 的MHC II类分子的表达程度相比，NSCs在按照LIF+A方法培养之后 表现出至少降低的MHC II类分子的表达。
在本发明的另一方面，由至少在存在LIF的情况下培养了一段时 间的NSC细胞群产生的NSCs数量大于由其它方面相同的在不存在 LIF的情况下培养的NSC细胞群产生的NSCs的数量。
在本发明的再一方面，由按照LIF+A方法培养的NSC细胞群产生 的NSCs数量大于由其它方面相同的在不存在LIF的情况下培养的 NSC细胞群产生的NSCs的数量。
使用ADAS细胞的方法
可以按照常规程序冷藏此处所述的NSCs。优选地，将大约一个至 一千万个细胞在气相液氮中冷藏在含有10%DMSO的NSC介质中。可 以通过在37。C浴中旋转来将冷冻细胞解冻、再悬浮在新鲜增殖培养基 中，并照常生长。
在另一具体实施方案中，本发明提供了包含之前难以获得的大量 神经元以及星形细胞和少突细胞的分化细胞培养基。通常，使用本领 域中的方法，人类NSC培养物形成非常少的神经元。按照本文公开的 方法，由于可以产生较大量的NSCs，可以获得较大量的神经元。因此， 本发明的方法是极其有利的，因为它们有利于在植入患有神经元功能 受损或缺失的紊乱或疾病的患者体内之前产生较大量的神经元细胞 群。
本发明还涉及下述发现——通过在存在LIF的情况下作为贴壁细 胞群培养NSCs，可以调节NSCs的MHC分子表达。本文公开的内容 表明，与使用本领域已知的标准方法培养的NSCs的MHC分子表达相比，除了在保持期多向分化潜能的同时提高NSCS的增殖，按照本文包
含的方法培养NSCs还调节了 NSCs的MHC分子表达的上调和/或诱 发。也就是说，本发明提供了以下述方式培养NSCs的方法一其提供 了优于在培养物中提高NSCs增殖所用的标准方法的额外益处。这些益 处包括，但不限于，在保持NSCs的多向分化潜能的同时提高NSCs的 增殖，并调节NSCs的MHC分子表达。优选地，按照LIF+A方法培养 细胞以产生适合治疗用途的细胞群。不希望受制于任何特定理论，使 用LIF+A方法产生的NSCs还适合植入患者体内，因为NSCs表达的 MHC II类分子的量为降低移植NSCs的宿主排异风险的量。
这种使用本文公开的方法可以调节MHC分子表达的发现提供了 一种产生可用于治疗、诊断、实验用途和类似用途的NSCs群的方法。 例如，与现有技术中已知的方法相比，使用本文公开的方法实现的 NSCs的降低的MHC分子表达提供了一种降低NSCs的免疫原性的方 法。优选地，NSCs的降低的MHC分子表达提供了一种提高NSCs植 入受体的成功机率的方法。
已经公认的是，在基因全异的个体(同种异体的)之间的细胞移 植总是与移植物排异风险相连。几乎所有细胞都表达主要组织相容性 复合体，MHC I类分子。此外，在暴露在促炎细胞因子中时，可以诱 使许多细胞类型表达MHC II类分子。同种异体移植物的排异主要是以 认出MHC I类和II类分子的CD4和CD8子类的T细胞为中介的。移 植时的主要目标是在不引发受体产生的移植物排异免疫响应情况下的 给体移植物的永久植入。由此，本发明包括通过在移植之前使用本文 公开的方法培养NSCs以降低NSCs的MHC分子表达，从而降低和/ 或消除受体细胞对受体内的植入NSCs的免疫响应的方法。不希望受制 于任何特定理论，使用本文公开的方法降低NSCs的MHC分子表达可 以减少NSCs的细胞膜上存在的MHC分子的数量，由此降低NSCs在受体中的免疫原性。
通过本领域已知的使NSCS分化成所选类型的细胞的培养条件的
选择，由本发明的方法获得的NSCs可以被诱导以分化成神经元、星形
细胞、少突细胞和类似细胞。
如本公开所述培养或扩增的NSCs可用于治疗本领域已知的可使 用NSCs治疗的各种紊乱症。这些治疗方法中可用的NSCs可以包括其 中插入或未插入外源基因的那些NSCs。这些紊乱症的例子包括但不限 于，脑外伤、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏症、帕金森症、脊髓损 伤、中风、多发性硬化、癌症、CNS溶酶体贮积症和头部外伤。
此处所述的本发明的NSCs和它们的分化能力可以使用已知技术 固定或有条件地固定。或者，可以使用NSCs作为原始培养物，由此还 没有以转化或固定NSCs的方式培养细胞。
本发明的NSCs具有多种用途，包括药物筛选、诊断、基因组技术 和移植。可以使用本发明所述的合适的培养基诱导本发明的细胞分化 成所选神经细胞类型。可以在分化之前加入受试药物以测试发展抑制， 或在分化之后加入以监测神经细胞类型的特异性反应。
基因变异
本发明还可用于获得表达外源基因的NSCs，这样NSCs可用于例 如细胞治疗法或基因治疗法。也就是说，本发明可以制造表达外源基 因的大量NSCs。外源基因可以，例如，是外源基因的外源变体(也就 是说，可以使用相同基因的野生型变体代替包含突变的缺陷等位基 因)。外源基因通常，但不必与一种或多种附加基因共价连接(也就是 "融合")。示例性"附加"基因包括用于"正向"选择的基因以选择 已经包含了外源基因的细胞，和用于"负向"选择的基因以选择已经 在与外源基因相同的染色体位点中包含外源基因的细胞。此处使用的术语"基因变异"是指通过有意加入外源DNA产生的 NSC的基因型的稳定或暂时变化。DNA可以是合成的或天然生成的， 并可以包含基因、基因片段、或其它可用的DNA序列。此处使用的术 语"基因变异"不包括天然产生的变异，例如通过天然病毒活性、天 然基因重组或类似因素产生的变异。
可以使用病毒载体(逆转录病毒、变异疱疹病毒、疱疹病毒、腺 病毒、腺联病毒、慢病毒和类似物)或通过直接DNA转染(脂质转染、 膦酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔和类似情况)在NSC中加入外源 DNA。本发明的基因变异细胞具有额外优点——具有使用许多分化规 程以可再现形式完全分化以产生神经元或分化细胞的能力。
当细胞的基因变异的目的是制造生物活性物质时，该物质通常是 可用于治疗指定CNS紊乱症的物质。例如，需要使细胞基因变异以使 它们分泌出特定的生长因子产物。
可以通过在细胞中加入外源基因材料，使本发明的细胞基因变异， 从而产生营养因子、生长因子、细胞因子、神经营养因子之类的分子， 这有益于培养细胞。此外，通过使该细胞基因变异以产生这种分子， 该细胞在植入有需要的患者体内时可以提供额外的治疗效用。
此处使用的术语"生长因子产物"是指对细胞具有生长、增殖、 分化或营养作用的蛋白质、肽、促细胞分裂剂或其它分子。可用于治 疗CNS紊乱的生长因子产物包括，但不限于，神经生长因子(NGF)、 脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子(NT-3、 NT-4/NT-5)、 睫状神经营养因子(CNTF)、双调蛋白(amphiregulin)、 FGF-1、 FGF-2、 EGF、 TGFa、 TGF;3s、 PDGF、 IGFs和白细胞介素;IL-2、 IL-12、 IL-13。
也可以使细胞变异以表达特定的生长因子受体(r)，包括但不限于， p75低亲合力NGFr、 CNTFr、 trk类神经营养因子受体(trk、 trkB、 trkC)、 EGFr、 FGFr和双调蛋白受体。可以对细胞进行基因工程以制造各种神经递质或它们的受体，例如血清素、L-多巴、多巴胺、去甲肾上腺素、
肾上腺素、速激肽、物质-P、内啡肽、脑啡肽、组胺、N-甲基D-天冬 氨酸酯、甘氨酸、谷氨酸酯、GABA、 Ach和类似物。可用的神经递质 合成基因包括TH、多巴脱羧酶(DDC)、 DBH、 PNMT、 GAD、色氨 酸羟化酶、ChAT和组胺脱羧酶。编码可用于治疗CNS紊乱的各种神 经肽的基因包括物质-P、神经肽-Y、脑啡肽、加压素、VIP、胰高血糖 素、铃蟾肽、肠促胰酶肽(CCK)、生长抑制素、降血钙素基因相关肽， 和类似物。
按照本发明，在NSCs中引入包含编码异性蛋白的核苷酸序列的基 因构造。也就是说，使细胞基因变异以引入下述基因——该基因的表 达对个体具有治疗效用。按照本发明的一些方面，来自待治疗的个体 或来自另一个体或来自非人类动物的NSCs可以基因变异以取代基因 缺陷和/或引入下述基因——该基因的表达对接收治疗的个体具有治疗 效用。
在将基因构造转染到细胞内的所有情况下，可切实地将异种基因 连接到实现该细胞内的基因表达所需的调节序列上。这些调节序列通 常包括促进子和聚腺苷酸化信号。
基因构造优选以下述表达载体的形式提供——该表达载体包括可 切实地与基本调节序列连接的异种蛋白的编码序列，从而在将该载体 转染到细胞内时，由该细胞表达编码序列。可切实地将编码序列连接 到该序列在细胞中的表达所必须的调节元件上。编码蛋白质的核苷酸 序列可以是cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物或RNA 分子(例如mRNA)。
基因构造包括编码可切实地连接到调节元件上的有益蛋白质的核 苷酸序列并可以仍然作为功能性细胞质分子、功能性附加体分子存在 于细胞中，或者其可以结合到细胞的染色体DNA中。可以在细胞中加式作为分离的基因材料存在。
或者，可以在细胞中引入可以结合到染色体内的线性DNA。当在细胞 中引入DNA时，可以加入促进DNA结合到染色体内的试剂。可用于 促进结合的DNA序列也可以包含在DNA分子中。或者，可以在细胞 中引入RNA。
用于基因表达的调节元件包括促进子、起始密码子、终止密码 子、和聚腺苷酸化信号。这些元件优选可用于本发明的细胞。此外， 这些元件优选可切实地连接到编码蛋白质的核苷酸序列上，从而可以 在细胞中表达该核苷酸序列并因此可以制造该蛋白质。起始密码子和 终止密码子通常被视为编码蛋白质的核苷酸序列。然而，这些元件优 选在细胞中是功能性的。类似地，所用促进子和聚腺苷酸化信号必须 在本发明的细胞中是功能性的。可用于实施本发明的促进子的例子包 括，但不限于，在许多细胞中活性的促进子，例如细胞巨化病毒促进 子、SV40促进子和逆转录病毒促进子。可用于实施本发明的促进子的 其它例子包括，但不限于，组织特异性促进子，也就是在一些组织中 发挥作用但是在其它组织中不发挥作用的促进子；以及，通常在含或 不含特异性或普通增强子序列的细胞中表达的基因的促进子。在一些 具体实施方案中，使用在含或不含增强子序列的细胞中组成性 (constitutively)表达基因的促进子。在适当时或需要时，在这种具体 实施方案中提供增强子序列。
可以使用本领域普通技术人员容易获得的公知技术转染本发明的 细胞。可以使用标准方法在细胞中加入外源基因，其中该细胞表达用 该基因编码的蛋白质。在一些具体实施方案中，通过磷酸钙沉淀转染、 DEAE葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转移、配体介
导的转移或重组病毒载体转移，来转染细胞。
在一些具体 实施方案中，使用重组腺病毒载体在细胞中引入具有所需序列的DNA。在一些具体实施方案中，使用重组逆转录病毒载体 在细胞中引入具有所需序列的DNA。在一些具体实施方案中，使用标 准CaP04、 DEAE葡聚糖或脂质载体介导的转染技术在分离的细胞中 引入所需DNA。可以使用标准抗生素抗性选择技术识别和选择转染细 胞。在一些具体实施方案中，通过显微注射在细胞中直接引入DNA。 类似地，可以使用公知的电穿孔或粒子轰击技术在细胞中引入外来 DNA。通常将第二基因共转染或连接到治疗基因上。第二基因通常是 可选的抗生素抗性基因。可以通过在杀灭细胞且不针对可选基因的抗 生素中培养细胞来选择转染细胞。在两个基因未连接和共转染的多数 情况下，在抗生素处理中存活的细胞中含有这两种基因且表达这两种 基因。
分离的神经干细胞的应用
分离的神经干细胞可以多种方式使用。可以使用这些细胞重新构 成哺乳动物中已经由于疾病或受伤而丧失的细胞。可以通过自体或同 种异体神经干细胞治疗基因疾病以校正基因缺陷或提供保护以免于疾 病。也可以使用NSCs治疗与特定分泌产物(例如激素、酶、生长因子 或类似物)的缺失有关的疾病。CNS紊乱包括多种折磨，例如神经退 行性疾病(也就是阿尔茨海默氏症和帕金森症)、急性脑损伤(例如中 风、颅脑损伤、脑性麻痹)和大量的CNS机能障碍(也就是抑郁、癫 痫和精神分裂)。包括但不限于阿尔茨海默氏症、多发性硬化(MS)、 亨廷顿氏舞蹈症、肌萎縮性侧索硬化症(ALS)和帕金森症在内的疾 病均与CNS的特定位置的神经细胞退化有关，从而造成这些细胞或大 脑区域失去执行其预定功能的能力。如本文所述分离和培养的NSCs 可以用作祖细胞或定型细胞的来源以治疗这些疾病。
如本文所述培养的NSCs可以在液氮温度下冷冻并长时间储存，此后可以将它们解冻并能够再使用。通常将细胞储存在10% DMSO和 90%完全培养基中。 一旦解冻，就可以使用本文其它地方描述的方法扩 增细胞。
可以预想到，通过本领域已知的使NSCs分化成所选类型的细胞的 培养条件的选择，由本发明的方法获得的NSCs可以被诱导以分化成神 经元、星形细胞、少突细胞和类似细胞。例如，在不存在生长因子但 是存在10%牛胎儿血清(FBS)的情况下将细胞覆盖在涂布表面，优选 聚鸟氨酸或聚-L-赖氨酸(PPL)上，可以诱导NSCs分化。通过将细胞 装在被离子带电表面(例如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸和类似物)覆盖 的固定基材(例如烧瓶、板材或盖玻片)上。可以使用其它基材诱导 分化，例如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、MATRIGEL (Cololaborative Resarch)和类似物。
诱导神经干细胞后代分化的优选方法包括在不含诱导增殖的生长 因子的培养基中的固定基材上培养细胞。在去除诱导增殖的生长因子 后，细胞粘附到基材(也就是聚-鸟氨酸-处理过的塑料或玻璃)上、变 平，并开始分化成神经元和神经胶质细胞。在这一阶段，培养基可以 含有血清，例如0.5-1.0%牛胎儿血清(FBS)。然而，对于某些应用， 如果需要指定条件，应该不使用血清。在2-3天内，多数或所有神经干 细胞后代开始失去对巢蛋白的免疫反应性并如本领域公知的免疫细胞 化学技术所测定，开始表达对神经元、星形细胞或少突细胞特异性的 抗原。特别地，神经元的细胞标记物包括，但不限于，神经元特异性 烯醇酶(NSE)、神经丝(NF)、 /3-微管蛋白、MAP-2;且对于神经胶 质，包括GFAP、半乳糖脑苷脂(GalC)(少突细胞的髓磷脂糖脂标识 物)和类似物。
如本公开所述培养或扩增的NSCs可以照培养好的状态使用，或者 可以在分化成所选细胞类型之后使用，以治疗本领域已知的可使用NSCs治疗的各种紊乱。这些治疗方法中可用的NSCs可以包括其中插 入或未插入外源基因的那些NSCs。可治疗的紊乱的例子包括但不限 于，脑外伤、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏症、帕金森症、脊髓损 伤、中风、多发性硬化、癌症和其它这样的疾病和/或损伤，其中用本 发明的细胞进行的组织替换可以治疗或缓解这些疾病和/或损伤。
本发明包括将本发明的细胞施用到动物，包括人类身上以治疗引 入新的未损伤的细胞可以产生一定形式的治疗性缓解的疾病。
本发明的细胞可以作为NSC或已经被诱导分化以表现出神经元之 类的细胞的至少一种特征的NSC。技术人员容易离解，NSCs可以作为 分化细胞，例如神经元施用到动物上，并可用于替换动物体内的染病 或受损神经元。或者，可以施用NSC，并在从周围环境中接收信号和 提示之后，可以分化成受相邻细胞环境支配的所需细胞类型。
可以制备用于移植的细胞以确保在体内环境中的长期存活。例如， 细胞可以在适合细胞生长和维持的培养基中增殖，并使其群集。使用 例如缓冲溶液，例如补充了 1毫克/毫升葡萄糖、0.1毫克/毫升MgCl2、 0.1毫克Z毫升CaCl2的含有0.05 4咦蛋白酶的磷酸盐缓冲的盐水(PBS) (完全PBS)加上5%血清以使胰蛋白酶失活，使细胞与培养基材分离。 可以用PBS洗涤细胞，然后再悬浮在不含胰蛋白酶并处于用于注射的 所选浓度的完全PBS中。
除了 PBS，可以使用任何与宿主生理相容的渗透平衡溶液使给体 细胞悬浮并注射到宿主体内。适合肠道外给药的药用组合物的制剂包 含与药用载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)结合的活性成分，也就 是细胞。这些制剂可以以适合大丸剂给药或连续给药的形式制备、包 装或出售。可以以单位剂型，例如在安瓿中或在包含防腐剂的多剂量 容器中制备，包装或出售。用于肠道外给药的制剂包括，但不限于， 悬浮液、溶液、在油性或水性载体中的乳状液、糊状物和可植入缓释或可生物降解的制剂。这些制剂可以进一步包含一种或多种附加成分， 包括但不限于，悬浮剂、稳定剂或分散剂。
本发明还包括与其它治疗程序结合移植NSCs (或分化NSCs)以 治疗CNS和周缘区域的疾病或外伤。因此，本发明的细胞可以与其它 细胞共同移植，它们都可以是对患者产生有益作用的基因变异和未基 因变异的细胞。因此，根据本文提供的论述，如本领域技术人员理解 的那样，本文公开的方法可以与其它治疗程序结合。
细胞可以以包含单细胞的混合物/溶液或包含细胞聚集体悬浮液的 溶液形式移植。这种聚集体的直径可以为大约10-500微米，且更优选 大约40-50微米。细胞聚集体可以每球包含大约5-100个，更优选大约 5-20个细胞。移植细胞的密度可以为每微升大约10,000至l，OOO,OOO 个细胞，更优选每微升大约25,000至500,000个细胞。
本发明的细胞移植可以使用本领域公知的技术以及本文描述的技 术或将来开发出的技术实现。本发明包括将NSCs或分化的NSCs移植、 接合、注入或以其它方式加入动物，优选人类体内的方法。下面举例 说明将细胞移植到啮齿动物和人类大脑中的方法，但是本发明不限于 这些解剖位置或不限于这些动物。此外，骨移植方法是本领域公知的 并如美国专利4,678,470中所述，在美国专利6,342,479和美国专利 5,571,083中描述了胰腺细胞移植物，它们描述了将NSCs之类的细胞 移植到体内的任何解剖位置的方法。
细胞也可以被包囊并用于按照已知的包囊技术(包括微囊化(参 看，美国专利4,352,883、 4,353,888和5,084,350，经此引用并入本文) 或大胶囊化(参看，美国专利5，284，761、 5,158,881 、 4,976,859和 4,968,733和国际公开WO 92/19195、 WO 95/05452，均经此引用并入 本文)输送生物活性分子。对于大胶囊化，可以改变胶囊中的细胞数; 优选每个胶囊含有103-109个细胞，最优选大约105至107个细胞。可以将数个大胶囊化胶囊植入患者体内。大胶囊化和细胞移植方法是本领
域公知的并如美国专利6,498,018所述。
本发明的细胞可用于表达用于治疗用途的外来蛋白或分子,或用于 追踪它们在患者组织内的合并和分化的方法。因此，本发明包括表达 载体，和在细胞中加入外源DNA的方法，其中在细胞中伴随着外源 DNA的表达，例如在Sambrook等(2002， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)禾口在 Ausubel等(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)中描述的那些。
分离的核酸可以编码用于追踪NSCs在植入患者体内之后的迁移、 合并和存活的分子，或者它们可用于表达在患者体内突变、有缺陷或 以其它方式机能失调的蛋白质。用于追踪的蛋白质可以包括，但不限 于，本文其它地方公开的绿色荧光蛋白(GFP)、任何其它荧光蛋白(也 就是增强的绿色、青色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech, Palo Alto, CA)，或其它标记蛋白(也就是，LacZ、 FLAG-tag、 Myc、 His6、和类 似物)。或者，在NSC细胞中加入的分离的核酸可以包括，但不限于 CFTR、氨基已糖苷酶、和本领域公知的或将来开发出的其它基因疗法。
追踪本发明的细胞的迁移、分化和合并，不限于使用由载体或病 毒表达的可检测分子。可以使用能够定位移植NSCs的一系列探子 (probes)测定细胞迁移、合并和分化。这些探子包括人类特异性Alu 的探子，其是在每5000个碱基对中以大约1个存在的丰富的转座因子， 由此能够使技术人员追踪NSC移植物的进程。追踪NSC移植物可以 进一步使用本文其它地方详述的细胞特异性标记物的抗体或核酸探子 (例如NeuN、 MAP2、神经丝蛋白和类似物)实现。
分离的核酸(单独或融合到可检测标记多肽上)在NSCs中的表达 可以如下实现在载体要加入的NSCs中，在含或不含标记的情况下产生质粒、病毒或其它类型的载体(其包含可切实连接到用于驱动蛋白 质表达的促进子/调节序列上的所需核酸)。可用于驱动基因的组成性表 达的许多促进子/调节序列是本领域中可得的，并包括但不限于，例如， 细胞巨化病毒立即早期促进子增强子序列、SV邻早期促进子、以及 Rous肉瘤病毒促进子和类似物。此外，所需核酸的可诱导和组织特异 性表达可以通过将带或不带标记的所需核酸置于可诱导或组织特异性 促进子/调节序列的控制下来实现。可用于此目的的组织特异性或可诱
导促进子/调节序列包括，但不限于，MMTV LTR可诱导促进子、和 SV40晚期增强子/促进子。此外，本发明还设想了本领域公知的在诱导 剂(例如金属，糖皮质激素、激素、抗生素(例如四环素)和类似物) 作用下诱导的促进子。因此，要理解的是，本发明包括任何促进子/调 节序列的使用，它们是已知或未知的并且能够驱动可与其连接的相关 蛋白的表达。
在机能失调的蛋白质的表达引起与这种表达有关的疾病、紊乱或 病症时，由促进子/调节序列驱动的来自NSCs的校正蛋白的表达可以 提供有效的治疗，包括但不限于基因治疗。在本文其它地方公开了与 机能失调的蛋白质相关的疾病、紊乱和病症并且是本领域中公知的。 任何特定质粒载体或其它DNA载体的选择不是本发明的限制因素，并 且极多的载体是本领域中公知的。此外，本领域技术人员能够很好地 选择特定的促进子/调节序列并可切实地将这些促进子/调节序列连接 到所需多肽的编码DNA序列上。这种技术是本领域中公知的，并且如 Sambrook等(2002, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)禾口在Ausubel等(1997， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)中所述。
本发明因此包括包含载体的NSC——该载体编码分离的核酸，该 核酸编码所需蛋白质或其它分子。在载体中并入所需核酸和载体的选择是本领域中公知的，并且如Sambrook等(2002, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)禾口在 Ausubel等(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)中所述。
可以将编码所需蛋白质的核酸克隆到各种质粒载体中。然而，本 发明不应该被认为限制于质粒，或限制于任何特定载体。相反，本发 明包括非常多的本领域中容易获得和/或公知或将来开发出的载体。
本发明还包括重组NSC，其尤其包含分离的核酸。 一方面，重组 细胞可以用编码一部分所需核酸的质粒短暂转染。核酸不需要合并到 细胞基因组中，也不需要在细胞中表达。
本发明包括NSC，当在其中引入本发明的转基因，且由其表达用 所需基因编码的蛋白质时(其中其之前在细胞中不存在或未表达，或 其中其现在以一定量表达或处于与引入该转基因之前不同的状态下)， 获得益处。这种益处可以包括下述事实——提供了可以在实验室中体 外研究或在该细胞成活的哺乳动物中研究相关基因的表达的系统，可 以使用引入的基因作为研究、诊断和治疗工具的系统，和对于哺乳动 物体内的所选疾病状况产生可用于形成新的诊断和治疗工具的哺乳动 物模型的系统。
可以使用表达所需分离核酸的NSC为细胞、组织或整个哺乳动物 提供分离核酸产物，其中较高量的基因产物可以有效治疗或缓解与异 常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或病症。因此，本发明包括表达所 需分离核酸的NSC，其中所需蛋白质的提高的表达、蛋白质量和/或活 性可用于治疗或缓解疾病、紊乱或病症。
提出下列实施例以更充分阐释本发明的优选实施方案。这些实施 例决不构成对所附权利要求界定的本发明范围的限制。实施例
实施例1: LIF和涂布烧瓶对hNSC生长的影响
在本实施例中，在涂布盘上作为贴壁细胞群培养人类NSCs。在存 在LIF的情况下，在涂布盘上作为贴壁细胞群培养人类胎儿NSCs,将 细胞增殖速率提高了大约3-7倍，并且细胞未丧失它们分化成神经元、 星形细胞、少突细胞和类似物的能力。
现在描述本实施例的实验中使用的材料和方法。
人类胎儿神经干细胞的分离和培养
人类胎儿脑组织购自Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA)。将该组织用补充了青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲的盐水(PBS) 溶液洗涤。然后将该组织在无菌陪替氏培养皿中置于补充了青霉素/链 霉素的冷PBS中以进一步清洗该组织并去除menninges。用一对镊子切 取该组织以将组织分成较小的碎片。可以使用Pasteur吸移管(大约20 次)进一步分离组织以研碎该组织。该组织可以再用经过火焰磨光 (fire-polished)以明显降低内径的Pasteur吸移管(20次)进一步分离 以研碎该组织。
通过在室温下以1000 rpm离心处理5分钟，将所得细胞丸片化。 将细胞丸片再悬浮在10毫升培养基(DMEM/F12 (Invitrogen)， 8mM 葡萄糖、谷氨酰胺，20mM碳酸氢钠、15mM HEPES、8微克/毫升Heparin
(Sigma)、 N2补充剂(Invitrogen)、 10纳克/毫升bFGF (Peprotech)、 20纳克/毫升EGF (Peprotech))中。将细胞加载到带有通气盖的涂布 的T-25平方厘米烧瓶上，并在5。/。C02培养器中在37"C培养。在只存 在bFGF和EGF的情况下初始培养(优选1-2代)之后，将在存在LIF
(Sigma)的情况下生成的细胞装入含有10纳克/毫升LIF的完全培养 基中。每隔一天将50%培养基换成新鲜的完全培养基。为了使细胞传代(passage)，使用在PBS中的0.05%胰蛋白酶EDTA 将细胞胰蛋白酶化2-3分钟，然后加入大豆胰蛋白酶抑制剂以使胰蛋白 酶失活。在室温下以1200rpm将细胞丸片化5分钟，然后再悬浮在培 养基中。将细胞以100，000-125，000个细胞/平方厘米装载在涂布烧瓶上。 将细胞冷藏在1(T/。DMSO+90。/。完全培养基中。
烧瓶涂布
为了涂布烧瓶，在烧瓶中加入在1XPBS中的15微米/毫升聚鸟氨 酸(Sigma)，并将烧瓶在37C在培养器中培养过夜。第二天从烧瓶中 去除过量聚鸟氨酸。将烧瓶用IX PBS洗涤三次，并在烧瓶中加入在 1XPBS中的10微米/毫升人类纤连蛋白(Chemicon)，并将烧瓶在37 。C培养至少4小时。使用"涂布"烧瓶培养本发明的细胞之前，从烧 瓶中去除过量纤连蛋白。
分化检定法
在存在10纳克/毫升脑源性神经营养因子(BDNF) (Peprotech) 的情况下分化NSCs。将细胞以100,000个细胞/室的量加载到在不含 bFGF或EGF的完全培养基中的涂布室玻片上4天。4天后，将完全培 养基换成包含20nM GlutaMax (Gibco和B-27补充剂的neurobasal 培养基再4天，然后换成neurobasal+20Nm GlutaMax (Gibco) +B-27+10纳克/毫升BDNF达1周。使细胞分化15天，然后将细胞固 定以准备进行免疫染色。每周三次在细胞中加入合适的培养基。
免疫染色
将培养物在室温在用在IXPBS中的4%多聚甲醛固定15分钟，然 后用1XPBS洗涤三次，每次IO分钟。在准备用于免疫染色的过程中，用0.1% Triton X-100处理细胞以使细胞可渗透；然后使用在IX PBS 中的5%普通羊血清在室温下将细胞阻断(block) 2小时，然后用在IX PBS中的5。/。普通羊血清稀释的第一抗体在4。C培养过夜。第二天，在 去除第一抗体后，将细胞用1XPBS洗涤三次，并用稀释的第二抗体在 室温下培养2小时。用1XPBS将第二抗体洗涤三次，每次10分钟。 将染色的细胞放置在Fluormount G (Southern Biotechnology Associates ) 上并用盖玻片盖住。
所用第一抗体是人类特异性巢蛋白，1:10 (R&D Systems); MAP2， 1:500 (Sigma); GFAP (星形细胞细胞骨架标记物)，1:1000 (DAKO); 04， 1:1000 (Chemicon); BrdU-Alexa 488共轭1:20 (Molecular Probes)。 这些实验中使用的第二抗体是Alexa Fluor 488鸡抗鼠，l:500(Molecular Probes)禾卩Alexa Fluor 594鸡抗兔，1:500 (Molecular Probes)。
为了测定不同细胞表型的数量，在室温下用DAPl (Sigma)将细 胞核染色10分钟。对于每次定量分析，使用40X目标物计算来自每一 室的三个不同区域。通过点算DAPI染色细胞核的数量，可以得出细胞 总数。还点算巢蛋白免疫反应性(ir)或GFAP-ir和MAP2-ir细胞。计 算每一表型的比例。
现在描述本实施例中所示实验的结果。
人类神经干细胞培养物的生长
人类神经干细胞培养物来自人类胎儿大脑样品，并在存在bFGF 和EGF的情况下生长。用解剖组织标记(FB二前脑，HB二后脑，WB =全脑，SC二脊髓)和样品号(001-025)标示每一培养物。由一些样 品产生含和不含hLIF的两个类似培养物。所有培养物均在涂布烧瓶上 培养。最初，细胞粘附到烧瓶上，但是在连续增殖后也形成小的细胞 群，并且许多大的细胞群据观察从烧瓶表面脱离并自由浮动。在培养14-16天之后，使细胞传代。图1描绘了 THD-hWB-015和THD-hFB-017
培养物在存在和不存在LIF的情况下的细胞。这些培养物中的一些连 续培养超过7个月或直至17代(passage),并且冷藏。由冷藏样品解 冻而得的细胞表现出超过90%的存活力并成功地扩增。 LIF和涂层对生长速率的影响
在每一次传代后，点算活细胞的总数并在存在或不存在LIF的情 况下计算扩增的总倍数。使用Microsoft Excel绘制所得生长曲线(图2)。 最初，仅在存在bFGF和EGF的情况下生长的最初3-4代培养物 (THD-hWB-015和THD-hFB-017)表现出与在存在bGFG、 EGF和 LIF的情况下生长的细胞类似的扩增速率。经过14-16天，在不存在 LIF的情况下生长的随后传代的细胞表现出比在存在LIF的情况下生 长的细胞慢3-5倍的生长速率。THD-hWB-015细胞与THD-hFB-017 相比，表现出更大的生长速率差异。评定在这些培养物中的BrdU并入 以确定扩增倍数的差异是否应归因于活性增殖。在不存在LIF的情况 下平均有20-30%包含BrdU的细胞，而在LIF存在的情况下有70-85% 包含BrdU的细胞。
LIF对神经干细胞标记物，巢蛋白表达的影响
巢蛋白是在许多类型的未分化CNS细胞中发现的中间丝蛋白。每 隔三代，通过免疫细胞化学分析测试细胞的巢蛋白表达。在固定之前， 将细胞加载到在完全培养基中的涂布室玻片上24小时。用抗巢蛋白和 抗-GFAP抗体将固定的细胞染色，同时用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚盐酸 盐(DAPI)将细胞核染色，从而点算细胞总数。在不存在LIF但是存 在bFGF和EGF的情况下的未分化THD-hWB-015培养物中，86%的 细胞仅对巢蛋白呈阳性，8-10%的细胞对巢蛋白和GFAP呈阳性，而 3-4%的细胞仅对GFAP呈阳性。在THD-hWB-015+ LIF+ bFGF + EGF 的情况下，98。/。的细胞对GFAP和巢蛋白都呈阳性，而有1-2%的细胞仅对GFAP呈阳性(图4)。 GFAP是胶质原纤维酸性蛋白，星形细胞 的一种标记物。
LIF对NSC培养物的多能件的影响
除了巢蛋白表达，在用LIF培养之后评测NSC培养物的分化潜能。 将细胞加载到涂布室玻片上并通过提取生长因子并在分化培养基中培 养它们来使其分化14天。固定细胞并用抗-MAP2和抗-GFAP抗体染色。 通过用DAPI将细胞核染色，目测细胞总数。在THD-hWB-015细胞分 化之后，30-40n/。的细胞是GFAP阳性的，而60-80。/。的细胞是MAP2阳 性的。在存在LIF (THD-hWB-015+LIF)的情况下生长的相同培养物 在分化时表现出，30-45%的GFAP阳性细胞和55-66%MAP2阳性细胞。 对于THD-hFB-17， 60-70%的细胞是MAP2阳性，且25-30%是GFAP 阳性的。在THD-hFB-17+LIF的情况下，50-60%的细胞是MAP2阳性， 且40-45%的细胞是GFAP阳性(图5)。
为了评定LIF对这些培养物多能性的长期影响，测试来自 THD-hWB-015和THD-hFB-017培养物的晚期传代，例如晚至15代的 细胞。在这些晚期培养物传代中，与早期传代相比，没有观察到神经 元和星形细胞总数的明显差异。评测所有培养物在分化时的少突细胞。 在存在和不存在LIF的情况下都观察到极少的04-免疫反应细胞。
实施例2: LIF对生长和MHC II类分子表达的影响
在本实施例中，使用本文其它地方描述的方法培养人类NSCs。测 定LIF对生长速率和NSCs产生的某些基因表达的影响。特别地，评定 在培养基中LIF的持续存在对生长速率和NSCs产生的某些基因表达的 影响。使用本文其它地方论述的方法在涂布盘上培养三种类似的培养 物。细胞(i)在存在LIF的情况下生长(LIF+)， (ii)在不存在LIF 的情况下生长(LIF-)或(iii)在存在LIF的情况下生长大约7天，然后在不存在LIF的情况下生长7天(LIF+/-)。所有培养物都生长一共 14天。计算扩增速率并使用本文其它地方论述的方法评定这些培养物 上的特定干细胞和免疫标记物的表达。
据观察，在存在LIF的情况下培养的NSCs的倍增时间为大约24-24 小时，在不存在LIF的情况下为60小时，且在LIF+A培养的情况下为 28-30小时。在独立的实验中，还观察到，按照LIF+A方法培养的NSCs 的倍增时间大约为30-36小时。不希望受制于任何特定理论，倍增时间 被认为关系到NSCs的传代数。在所有情况下，NSCs是CD34-、 CD86-、 CD80-，但是超过90。/。的细胞是CD133+。在受试基因中，据观察，LIF 精密调节了NSCs的MHCII类分子表达。在存在LIF的情况下，在细 胞上表现出MHCI类分子、MHCII类分子和CD133分子。在LIF-和 LIF+A培养物中，几乎没有表现出MHCII类分子，但是这些培养物还 表现出MHC I类和CD133。
当细胞在存在LIF的情况下生长大约7天，然后在不存在LIF的 情况下再生长大约7天，据观察，细胞扩增20倍，而在存在LIF的情 况下生长大约14天时，细胞扩增30倍。还发现，与在存在LIF的情 况下生长大约14天的细胞的MHC II表达相比，当细胞在存在LIF的 情况下生长大约7天，然后在不存在LIF的情况下再生长大约7天时， NSCs的MHC II分子表达降低。
根据本公开，本领域技术人员可以意识到，对于将细胞用于同种 异体或自体移植，MHCII的低表达是合意的，因为降低的MHCII表 达可以降低或消除对免疫抑制的需求。
实施例3:人类NSCs的表征(人类NSCs的FACS分析)
收取细胞并在大约2X 106个人类NSCs上进行FACS分析。将细 胞在2毫升流动洗涤缓冲液[l XDPBS(Hyclone， Logan， UT)、0.5%BSA钠(Sigma， St. Louis, MO)] 洗涤一次，使用离心以550Xg将细胞丸片化5分钟，然后1X1(^个细 胞/毫升的量悬浮在阻断缓冲液[洗涤缓冲液+ 25微克/毫升鼠Ig
(Sigma， St. Louis， MO)]中。将细胞分成100微升等分式样，置于 冰上，并在添加单克隆抗体之前阻断10分钟。在这样培养之后立即进 行细胞存活力的碘化丙啶(PI)分析。在细胞悬浮液中以10微克/毫升 的量加入抗体，并在冰上培养30分钟。将细胞在2毫升洗涤缓冲液中 洗涤，并在200微升1%多聚甲醛(Electron Microscope Sciences)固定。 分析NSC细胞群的用于表型表征的下列抗体的表面表达CD 14
(Becton Dickinson (BD)， Lincoln Park, NJ)、 CD34(BD)、 CD45 (BD)、 CD80 (Caltag Laboratories, Burlingame， CA)、 CD86 (Caltag)、 CD133
(Miltenyi Biotech Inc., Auburn, CA)、 HLA-A,B，C (BD)和HLA腸DR
(BD)(除非另行说明，所有抗体均购自BD-Pharmingen)。根据相对 于它们各自的同型对照物的百分数(+)结果以及平均荧光强度值，进 行表达的最终分析。使用Cell Quest acquisition软件(BDIS)在Becton Dickinson FACSCaliber流式细胞仪上获得数据，并使用Flow Jo分析软 件(Tree Star)进行分析。
本文所列举的每一专利、专利申请和出版物的公开内容均完全经 此引用并入本文。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的精神 或范围的情况下对本发明的方法和组合物进行各种修改和变动。因此， 本发明旨在包含本发明的所有修改和变动，只要它们落在所附权利要 求及其对等物的范围内。
权利要求
1. 一种包含含有神经干细胞(NSC)的体外贴壁培养物的组合物，其中所述NSC在存在LIF的情况下增殖，同时保持所述NSC的多向分化潜能。
2. 权利要求1的组合物，其中所述NSC粘附到用聚鸟氨酸和纤连 蛋白涂布的表面上。
3. 权利要求1的组合物，其中所述NSC来自人类。
4. 权利要求1的组合物，其中已经在所述NSC中引入外源性遗传 物质。
5. —种神经干细胞(NSC)的多向分化潜能的体外扩增和维持方 法，所述方法包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的 形式培养所述NSC。
6. 权利要求5的方法，其中所述NSC粘附到用聚鸟氨酸和纤连蛋 白涂布的表面上。
7. 权利要求5的方法，其中所述NSC来自人类。
8. 权利要求5的方法，其中已经在所述NSC中引入外源性遗传物质。
9. 一种NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法，所述方法包 括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养所述 NSC，其中通过所述方法调节所述NSC中MHC II类分子的表达。
10. —种神经干细胞(NSC)的多向分化潜能的体外扩增和维持 方法，其中当与在持续存在LIF的情况下培养的其它方面相同的NSC 相比，所述NSC中MHCII类分子的表达降低，所述方法包括a)在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养 所述NSC—段时间，然后b) 从培养物中去除LIF，和c) 在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培 养所述NSC—段时间。
11. 权利要求10的方法，其中将所述NSCs在存在LIF的情况下 培养大约7天。
12. 权利要求10的方法，其中将所述NSCs在不存在LIF的情况 下培养大约7天。
13. 权利要求10的方法，其中在(c)之后，所述NSCs表现出 大约28-36小时的倍增速率。
14. 一种通过培养所述NSC的方法制成的分离的神经干细胞 (NSC)，该方法包括a) 在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养 所述NSC—段时间，然后b) 从培养物中去除LIF，和c) 在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培 养所述NSC—段时间。
15. 权利要求14的分离的NSC，其中所述NSC表现出大约28-36 小时的倍增速率。
16. 权利要求14的分离的NSC，其中与在持续存在LIF的情况 下培养的其它方面相同的NSC上的MHC II类分子表达量相比，所述 NSC表现出降低的MHC II类分子表达量。
17. 权利要求14的分离的NSC，其中所述NSC来自人类。
18. 权利要求14的分离的NSC，其中已经在所述NSC中引入外 源性遗传物质。
19. 一种治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的人类患者的 方法，该方法包括i) 获得分离的神经干细胞(NSC)，ii) 在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养 所述NSC—段时间，iii) 从培养物中去除LIF，iv) 在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培 养所述NSC—段时间，和v) 将所述培养的NSC施用到所述人类患者的中枢神经系统上。
20. 权利要求19的方法，其中中枢神经系统的所述疾病、紊乱 或病症选自遗传疾病、脑外伤、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏症、 帕金森症、脊髓损伤、中风、多发性硬化、癌症、CNS溶酶体贮积症 和头部外伤、癫痫。
21. 权利要求19的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是对所述 中枢神经系统的组织或细胞的损伤。
22. 权利要求19的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是脑瘤。
23. 权利要求19的方法，其中施用到所述中枢神经系统上所述 的培养的NSCs仍然在所述中枢神经系统中存在和/或复制。
24. 权利要求19的方法，其中在施用所述NSC之前，进一步在 分化培养基中体外培养所述NSC。
25. 权利要求19的方法，其中在施用所述NSC之前，对所述 NSC进行基因改性。
26. —种包含分离的神经干细胞(NSC)和生物相容格栅的组合 物，其中通过下述方法制备所述NSC，该方法包括a) 在存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细胞群的形式 培养所述NSC—段时间，然后b) 从培养物中去除LIF，和c) 在不存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细胞群的形式培养所述NSC—段时间。
27. 权利要求26的组合物，其中格栅包括聚合材料。
28. 权利要求26的组合物，其中聚合材料是由聚合物纤维以网 状或海绵状构成的。
29. 权利要求26的组合物，其中聚合材料包括选自乙醇酸、乳 酸、富马酸丙酯、己内酯、玻尿酸、透明质酸和它们的结合物的单体。
30. 权利要求26的组合物，其中聚合材料包括蛋白质、多糖、 多羟基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈、合成聚合物或它们的结合物。
31. 权利要求26的组合物，其中聚合材料是通过其中分散有细 胞的聚合物悬浮液的交联形成的水凝胶。
32. 权利要求26的组合物，其中进一步用聚鸟氨酸涂布所述生 物相容格栅。
33. 权利要求26的组合物，其中进一步用纤连蛋白涂布所述生 物相容格栅。
34. 权利要求26的组合物，其中进一步用聚鸟氨酸和纤连蛋白 涂布所述生物相容格栅。
35. —种神经干细胞(NSC)的多向分化潜能的体外扩增和维持 方法，所述方法包括a) 在存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细胞群的形式 培养所述NSC—段时间，然后b) 从培养物中去除LIF，和c) 在不存在LIF的情况下在生物相容格栅上以贴壁细胞群的形 式培养所述NSC —段时间。
36. 权利要求35的方法，其中进一步用聚鸟氨酸涂布所述生物 相容格栅。
37. 权利要求35的方法，其中进一步用纤连蛋白涂布所述生物相容格栅。
38.权利要求35的方法，其中进一步用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂 布所述生物相容格栅。
全文摘要
本发明包括用于增强神经干细胞(NSCs)生长的方法和组合物。
文档编号A61K35/12GK101421394SQ200580008694
公开日2009年4月29日 申请日期2005年3月16日 优先权日2004年3月16日
发明者P·万谷芮, S·博恩赛尔 申请人:赛若代姆公司