小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基的制作方法

专利名称：小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基。
背景技术：
精原干细胞是部分未分化的A型精原细胞，位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管生精上皮基膜内，在复杂而高度有序的精子发生过程中占据极其重要的地位。精原干细胞是一种可以将基因传递给后代的干细胞，在雄性生物中精原干细胞正常的自我更新和增殖、分化保证了终生的生殖细胞供应。精原干细胞维持一定的数目以及保持正常的增殖、分化功能是确保男性生育的关键。在合适的环境和条件下，精原干细胞能够分化为其他组织的细胞精原干细胞的研究与应用需要获得长期培养并维持其体内分化能力的稳定细胞系，这些稳定细胞系的培养大都来自于幼年小鼠的睾丸组织，孙源等在《小鼠精原干细胞体外培养体系的建立[J].中华男科学杂志，2008，14(8) :695 700》中披露了以下内容取出生后2 6d的雄性ICR小鼠30只，脱颈法处死，切取睾丸后，采用两步酶消化法制成单细胞悬液，添加特定培养液，以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。对培养细胞进行鉴定，结果小鼠精原干细胞在体外稳定增殖，所得克隆AP强阳性，标记物检测 GFRa -l+/0ct-4+/VASA+/SCP3-，基因表达 GFR a -l+/0ct_4+/SCP3-，证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态，为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。《自然》杂志在2006 年第 440 卷第 7088 期第 1199 1203 页刊登了《Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis》(成年小鼠精原干细胞的多潜能性)一文，文中提及，成年个体精原干细胞可发育成各种组织。经对现有技术的文献检索发现，《突变研究》(Mutat. Res.)杂志在1993年第 290 期 193 200 页刊登了一篇名为《A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 Fl hybrid mouse》 (C3H/101 Fl杂交鼠中精原干细胞自我更新的定量研究)的文章，文中提及，在幼年个体中，大约每1 万个睾丸细胞中才有2 3个精原干细胞，仅占睾丸所有生精上皮细胞总数的0. 02% 0. 03%，而成年睾丸中精原干细胞所占的比例更低，分化程度更高，因而长期培养的难度更大。用成年小鼠精原干细胞建立细胞系并产生后代小鼠，在国内外均未见相关报道。因此， 本发明要解决的技术问题是如何在体外培养成年小鼠精原干细胞。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种小鼠精原干细胞的体外分离培养方法。利用本发明的方法，可使得来源于幼体或成体小鼠的精原干细胞均能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定生长的精原干细胞系，并且维持其精子发生的功能。
一种小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，包括如下步骤步骤一，收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备细胞悬液；

步骤二，利用免疫磁珠分选法分离出精原干细胞；步骤三，制备精原干细胞的培养液，对精原干细胞进行原代培养和传代培养。步骤一中，所述免疫磁珠分选法使用的磁珠为Thyl磁珠。步骤一中，所述Thyl磁珠为⑶90。步骤三中，所述原代培养和传代培养时加入STO细胞饲养层，所述STO细胞饲养层的制备方法具体为向STO细胞中加入含10 μ 1/ml丝裂霉素C的STO细胞培养液，之后于培养箱培养；PBS缓冲液洗涤；加入0. 25%胰蛋白酶，置于培养箱中消化4-5min ；加入STO 细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并用移液枪吹打，使细胞分散均勻；转移细胞悬液至离心管中，离心，弃去上清液，向离心管中加入STO细胞培养液，用移液枪吹勻细胞，然后分至铺有明胶的平皿中，加入STO细胞培养液，用移液枪将培养液均勻分散处理的细胞，培养24h后， 得到的STO细胞即可作为精原干细胞的饲养层。所述STO 细胞培养液配方88% DMEM，10% FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺，100U/ml
青霄素。步骤三中，所述传代培养具体为4-7天传代1次。本发明的另一个目的在于还提供一种小鼠精原干细胞的体外分离培养方法所使用的培养基，由STO细胞饲养层和精原干细胞培养液组成，所述精原干细胞培养液包括 MEM- α、FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰岛素、维生素C、EGF、⑶NF。优选地，所述精原干细胞培养液进一步包括非必需氨基酸、β-巯基乙醇、丙酮酸钠中的一种以上。优选地，所述FBS的体积百分含量为8-10%，所述LIF的含量为102_104U/ml，所述bFGF的含量为0. 02-0. 03μ g/ml，所述IGF-IR激活剂的含量为0. 04-0. 06μ g/ml，所述 EGF的含量为0. 01-0. 02 μ g/ml，所述维生素C的含量为40-60 μ g/ml，所述⑶NF的含量为 0.01-0. 02 μ g/ml。优选地，在所述精原干细胞培养液中，所述FBS的体积百分比为10%，所述LIF的含量为103u/ml，所述bFGF的含量为0. 025 μ g/ml，所述IGF-IR激活剂的含量为0. 05 μ g/ ml，所述维生素C的含量为50 μ g/ml，所述EGF的含量为0. 01 μ g/ml，所述⑶NF的含量为 0.01 μ g/ml。步骤三中，配制所述精原干细胞的培养液的具体步骤为100ml精原干细胞培养液的配制为取86. 8ml MEM- α，IOml FBS, Iml 30mg/ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸， Iml 100mmol/L 丙酮酸钠，0. 7μ 1β-巯基乙醇，100μ 1 106U/ml LIF, 5 μ 1 1 μ g/μ 1 胰岛素，5 μ 1 lmg/ml 维生素 C，2. 5μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1μ 11μ g/μ 1 ⑶NF ；将以上各组分混勻即得。所述非必需氨基酸购买自Invitrogen公司。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果利用本发明的方法，可使得来源于幼体或成体小鼠的精原干细胞均能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定的精原干细胞系，并且维持其精子发生的功能；同时，本发明的方法操作简便，安全可靠，成本低廉。


图1 稳定的小鼠精原干细胞系的建立的照片。(a)显示培养在丝裂霉素C处理过的STO细胞饲养层上24小时后的成年精原干细胞形态(箭头所示)。(b)培养4个月后， 典型的精原干细胞簇和克隆的形态。比例尺10μπι in a;50ym inb。图2 精原干细胞移植12周后的睾丸切片的照片，见精子发生。比例尺40μπι。图3 :C57BL/6来源的成年小鼠精原干细胞系移植入C57BL/6XCD-1 Fl代受体小鼠后，与纯种CD-I小鼠交配，并产生的后代。母亲为纯白色，后代均为黑色。图4 =PCR检测STPB-C转基因阳性小鼠的免疫荧光检测照片；M =DNA分子量标准； P 阳性对照；2和7 转基因阳性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。图5 =Southern杂交验证STPB-C转基因阳性小鼠的电泳图谱；M :DNA分子量标准； P 阳性对照；N 阴性对照；1和3 转基因阳性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。图6 =PCR检测STPB-C基因沉默小鼠的免疫荧光检测照片；M =DNA分子量标准；P 阳性对照；6，7，8，9和13 =STPB-C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11，12，14，15和16 野生型小鼠。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1小鼠精原干细胞系的建立与移植步骤一，幼年、成年或老年小鼠精原干细胞的分离将所需的幼年、成年或老年小鼠处死，用75%酒精棉球擦洗小鼠身体；迅速剖腹取双侧睾丸，将睾丸置于约含1/3体积D-Hanks液的冰浴平皿中，并去除睾丸组织的包膜； 另取一灭菌1. 5ml EP管，加入Iml D-Hanks液，将分离的生精小管转移至其中；取3. 5ml 含lmg/ml胶原酶的D-Hanks液至15ml离心管，将含生精小管的D-Hanks液吸入其中，并用 500 μ 1含胶原酶IV的D-Hanks冲洗残余组织，一起吸入15ml离心管中，使总体积为5ml ； 将15ml离心管置于37°C水浴，略振荡消化15min，消化完毕后，IOOOrpm离心5min，弃去上清液；加入5ml D-Hanks液于离心管中，IOOOrpm离心5min，弃去上清液，同法洗涤3次；力口入5ml含0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的D-Hanks液，37°C略振荡消化lOmin，而后加入 500 μ 1 FBS终止消化；IOOOrpm离心5min，弃去上清液；在细胞中加入400ml免疫磁珠分选 BD buffer (缓冲液)(购买自BD Biosciences公司)以及40 μ 1的Thyl磁珠(CD90)(购买自BD Biosciences公司)，轻轻混勻后，于6_8°C冰箱放置30min ；将1. 5ml离心管安装固定在磁珠分选架子上，加入混合液于离心管内，然后在磁珠分选架上放置6-8min ；缓慢吸走BD buffer (缓冲液)混合液，取下该离心管(详情参照BD Biosciences公司的产品手册(protocol))；加入1.5ml干细胞培养液重悬离心管中的磁珠分选的细胞，将细胞转入 Φ35mm培养皿或24孔板培养；培养3_4h后，可在显微镜下观察到混杂其中的体细胞开始贴壁，小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的精原细胞连同培养液(为精原干细胞培养液)一起吸出，另行接种培养。步骤二，小鼠精原干细胞的体外培养1、精原干细胞的培养液配方
IOOml精原干细胞培养液的配制具体为取86. 9ml MEM- α，IOml FBS, lml30mg/ ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸(购买自Invitrogen公司)，lmllOOmmol/L丙酮酸钠， 0. 7μ 1β-巯基乙醇，ΙΟΟμ 1 106U/ml LIF,5y 1 1 μ g/μ 1 胰岛素，5 μ 1 lmg/ml 维生素 C， 2. 5 μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF，1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 ⑶NF ；将以上各组分混勻即得。2、STO饲养层细胞的制备(1)取若干新的Φ60πιπι平皿，分别加入Iml明胶，室温于超净工作台放置2h后除
去明胶，继续将培养板置于超净工作台，晾干后待用；(2)吸去STO培养平皿中旧的培养液，向STO培养平皿中加入含10 μ 1/ml丝裂霉素C的STO培养液2ml (此培养液需事先置于培养箱进行平衡)，将STO培养平皿置于培养箱处理1. 5h，所述STO细胞培养液配方为88% DMEMUO % FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺和 100U/ml青霉素；(3)处理1.5h后，取出平皿，移去培养液，向STO培养平皿中加入Iml PBS缓冲液， 轻轻晃动STO培养平皿，弃去PBS缓冲液，如此反复操作5次；(4)向STO培养平皿中加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于培养箱中消化4-5min ；力口入等体积的新鲜STO培养液(不含丝裂霉素C)终止胰蛋白酶消化，并用移液枪吹打，使细胞分散均勻；(5)转移细胞悬液至12ml离心管中，IOOOrpm离心5min，弃去上清，向离心管中加入3ml STO培养液(不含丝裂霉素C)，用移液枪吹勻细胞，然后分至2-4个铺有明胶的步骤 (1)所述的Φ60πιπι平皿中，加入新鲜STO培养液(不含丝裂霉素C)至4ml，并用移液枪将培养液均勻分散处理的细胞；(6)处理后的STO细胞，培养24h后，即可作为精原干细胞的饲养层。3、精原干细胞的培养、建系37V,5% CO2条件下，于STO饲养层上培养精原干细胞，其中精原干细胞培养液的加入量，应根据培养孔或培养皿的大小决定，同时，为了维持该精原干细胞的特性，在精原干细胞的培养液中还需要加入其他特殊的细胞生长因子，如LIF，胰岛素，EGF,⑶NF，bFGF 等，具体配制详见第一步。通常，24孔培养板中，每孔加入500 μ 1精原干细胞培养液，而 Φ60mm培养平皿中，需要加入2ml精原干细胞培养液，同时每48小时换液1次，5-7天传代 1次。细胞传代方法传代之前必须要制备新的STO饲养层细胞，详见第2步操作。小心移去旧的精原干细胞培养液，加入0. 5ml 0. 25%胰蛋白酶清洗细胞表面，然后移去胰蛋白酶；加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于37°C培养箱，时间不应超过5min，等到细胞约一半脱落时，加入3ml 新鲜精原干细胞培养液终止消化；用移液枪轻轻吹散细胞，转移至离心管，IOOOrpm离心 5min,弃去上清液；加入2ml新鲜精原干细胞培养液，用移液枪吹散细胞，然后分至2_4个含有新处理的STO饲养层细胞的Φ60πιπι平皿中；各平皿加入新鲜精原干细胞培养液至4ml，并用移液枪将培养液均勻分散于整个平皿。图1的(a)显示了培养在丝裂霉素C处理过的 STO细胞饲养层上24小时后的成年精原干细胞形态(箭头所示)。(b)显示培养4个月后， 典型的精原干细胞簇和克隆的形态。比例尺10μπι in (a) ；50ymin(b)o4、小鼠精原干细胞系的移植(1)受体小鼠的准备针对4-6周龄雄性小鼠，按40mg/kg剂量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)。注射后，混合饲料喂养至少4周，存活小鼠睾丸生精功能被破坏，可作为受体鼠进行精原细胞移植。(2)精原干细胞悬液的准备用0. 25%胰蛋白酶消化培养物(为培养了 40代的细胞)，转移漂浮细胞至离心管，1，OOOrpm离心收集精原干细胞细胞，加入冷的灭菌PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为约 IO3/μ 1。(3)精原干细胞的移植按75mg/kg剂量，腹腔注射巴比妥钠麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身体，沿腹中线附近切开腹腔，挤出睾丸，用毛细玻璃管将细胞悬液多点注入小鼠曲细精管内，注意避免伤及血管。注射完毕后，将睾丸还入腹腔，缝合切口。移植两个月后，将术后雄鼠与雌鼠合笼。结果显示将来自精原干细胞系的精原干细胞移植于不孕雄性小鼠曲细精管内，经体内分化产生精子，与雌性小鼠交配产生小鼠后代，见图2，3。图2显示了精原干细胞移植 12周后的睾丸切片，见有精子发生，比例尺40μπι。图3显示了 C57BL/6来源的成年小鼠精原干细胞系移植入C57BL/6 X⑶-1 Fl代受体小鼠后，与纯种OT-I小鼠交配，并产生的后代。母亲为纯白色，后代均为黑色。实施例2获得过量表达STPB-C的基因工程小鼠步骤一，pFB-STPBC载体构建及重组病毒的收集1、pFB-STPBC 载体的构建(1)目的基因片段的准备pCMV-STPB-C质粒以Hind III和BamH I双酶切后，1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切下含目的基因片段的电泳带，用QIAEX-II Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收纯化STPB-C编码基因片段，重悬于TE溶液(500ml TE溶液中含有lOmmol/L Tris-HCl (pH = 8. 0) 6. 057g,与 lmmol/L EDTA (pH = 8. 0) 1. 8612g)中。(2)载体的准备将真核细胞表达载pFB-neo质粒以HindIII和BamH I双酶切。通过1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下含线性载体的电泳带，凝胶回收纯化，重悬于TE溶液中。(3)重组质粒的连接 将酶切回收的目的基因片段和线性pFB-neo质粒用T4 DNA连接酶连接(16°C，过夜)。(4)重组质粒转化大肠杆菌用热休克法将重组质粒和阴性对照空载质粒分别转化感受态大肠杆菌ToplO，接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养平皿，37°C恒温箱过夜。随机挑取平皿上的单个菌落， 接种于含Amp的4ml LB液体培养基，37°C振摇过夜。通过PCR方法进行重组子的筛选，阳性结果送至测序，进一步分析确定。2、重组病毒颗粒的收集取一个灭菌的EP管 ，加入3yg pFB-STPBC重组质粒、3yg pVPack-GP(gag-pol-expressing vector)禾口 3 μg ρVPack-VSV-G(env-expressing vector)，再加入Iml无水乙醇和0. 1倍体积的NaAc (3M)。用移液枪混勻后，置于_30°C共沉淀过夜。将混合质粒于4°C，12，OOOrpm离心lOmin，弃去上清液。然后加入Iml 70%乙醇，12，OOOrpm离心5min，弃去上清液。将混合质粒保存于4°C，过夜。转染293T细胞a.观察Φ60πιπι细胞培养平皿中293T细胞生长情况，当细胞生长至80%平皿时，方可用于转染实验。b.移去旧的培养液，加入4ml含MBS[来自 Stratagene公司的ViraPack Transfection kit (病毒包装转染试剂盒))的新鲜培养液，置于37°C培养箱培养。c.取出含混合质粒的离心管，加入450 μ 1灭菌超纯水，再加入 50 μ 1 Solution I 和 500 μ 1 Solution II [Solution I 和 II 分别来自 Stratagene 公司的 ViraPack Transfection kit (病毒包装转染试剂盒)]，用移液枪轻轻地混勻后，室温静置 IOmin0 d.取出培养的293T细胞，将上述液体加入到培养皿中，轻轻的摇晃平皿，注意不要将细胞漂浮。再将新细胞放回培养箱培养。e.3h后，移去平皿中的液体，加入4ml含25μΜ chloroquine的培养液。f. 6h后，再移去平皿中的液体，加入4ml不含chloroquine的培养液；收集病毒颗粒收集培养上清，用0. 45 μ m微孔滤器过滤至灭菌离心管中，立即置于液氮中，而后置于-70°C长期保存。步骤二，pFB-STPBC病毒颗粒感染精原干细胞根据实施例1所述小鼠精原干细胞体外分离培养方法培养精原干细胞4d后，将 STPB-C过表达载体病毒颗粒感染该细胞。感染方法如下(1)从-70°C低温冰箱中取出上述方法制备的含STPB-C载体病毒颗粒培养液，置于37°C水浴中溶解。(2)溶解后迅速加入 DEAE ( 二乙基-2-羟基乙胺)至终浓度为10 μ g/ml。(3)移去干细胞培养皿中旧的培养液， 加入上述含病毒颗粒与DEAE的培养液(24孔培养板每孔加200 μ 1含病毒颗粒培养液)。 (4)3h后向24孔培养板每孔补加200 μ 1新鲜干细胞培养液。步骤三，精原干细胞移植1、受体小鼠的准备对4-6周龄雄性小鼠按40mg/kg剂量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)， 混合饲料喂养至少4周后，存活小鼠睾丸生精功能被破坏，作为受体鼠进行精原细胞移植。2、pFB-STPBC病毒颗粒感染的精原干细胞细胞悬液准备用0.25%胰蛋白酶消化培养物，转移漂浮细胞至离心管，1，OOOrpm离心收集细胞，加入冷的灭菌PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞密度约为IO3/μ 1。3、上述精原干细胞手术移植按75mg/kg剂量，腹腔注射巴比妥钠麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身体，沿腹中线附近切开腹腔，挤出睾丸，并用毛细玻璃管将细胞悬液多点注入小鼠曲细精管内，注意避免伤及血管。注射完毕后，将睾丸纳入腹腔，缝合切口。移植两个月后，将术后雄鼠与雌鼠合笼。
结果表明精原干细胞移植于3只不育雄性小鼠曲细精管内，两只获得生育，共产生46只后代，经PCR检测以及Southern杂交进一步证实，其中2只为STPB-C转基因阳性后代，见图4、5。其中图4为PCR检测的STPB-C转基因阳性小鼠，M DNA分子量标准；P 阳性对照；2和7 转基因阳性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。图5为Southern杂交验证STPB-C转基因阳性小鼠；M :DNA分子量标准；P 阳性对照；N 阴性对照；1和3 转基因阳性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。实施例3 对培养的精原干细胞的验证1、精原干细胞的体外转染根据本发明所述方法进行体外分离并培养精原干细胞大约4天后，将表达目的基因或RNAi的DNA片段通过病毒载体转染精原干细胞。2、受体动物的准备受体动物可分为先天不育和后天施用药物导致不育两种。对于正常动物生精能力的破坏，目前多使用的是白消安(Busulfan，甲磺酸丁二醇二酯)，其作用机理是白消安能使DNA烷基化，从而破坏受体精原干细胞的增殖。因而通过注射白消安至少4周后可进行移植，白消安的用量根据实验动物的大小确定。3、精原干细胞的移植本发明采用曲细精管注射法来完成精原干细胞的移植。本方法是用手术显微镜注射装置，将经过基因改造的细胞系直接注射到受体动物的曲细精管。注射完毕，缝合伤口， 消炎看护，保证成活率。曲细精管注射法比较简单，容易掌握。移植后，经过一段时间雄鼠与雌鼠交配，可获得经过基因改造的子代小鼠。结果显示STPB-C基因沉默的精原干细胞分次植入5只不育雄性小鼠曲细精管内， 5只全部生育，共产生82只子代小鼠。通过PCR方法筛选并将其PCR产物测序验证，检测到5只STPB-C基因沉默的阳性小鼠(见图6)。图6显示PCR检测STPB-C基因沉默小鼠； M:DNA分子量标准；P 阳性对照；6，7，8，9和13 :STPB_C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11， 12，14，15和16 野生型小鼠。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备细胞悬液；步骤二，利用免疫磁珠分选法分离出精原干细胞；步骤三，制备精原干细胞培养液，对精原干细胞进行原代培养和传代培养。
2.根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，步骤一中，所述免疫磁珠分选法使用的磁珠为Thyl磁珠。
3.根据权利要求2所述的小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，所述 Thyl磁珠为CD90。
4.根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，步骤三中，所述原代培养和传代培养时加入STO细胞饲养层。
5.如权利要求1所述的小鼠精原干细胞的体外分离培养方法所使用的培养基，其特征在于，由STO细胞饲养层和精原干细胞培养液组成，所述精原干细胞培养液包括MEM- α、 FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰岛素、维生素C、EGF、⑶NF。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述精原干细胞培养液还包括非必需氨基酸、β-巯基乙醇、丙酮酸钠中的一种以上。
7.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述FBS的体积百分含量为8% -10 %， 所述LIF的含量为102-104U/ml，所述bFGF的含量为0. 02-0. 03 μ g/ml，所述IGF-IR激活剂的含量为0. 04-0. 06 μ g/ml，所述EGF的含量为0. 01-0. 02 μ g/ml，所述维生素C的含量为 40-60 μ g/ml，所述 GDNF 的含量为 0. 01-0. 02 μ g/ml。
全文摘要
本发明提供小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，包括如下步骤步骤一，收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备细胞悬液；步骤二，利用免疫磁珠分选法分离出精原干细胞；步骤三，制备精原干细胞的培养液，对精原干细胞进行原代培养和传代培养。本发明还提供所述方法使用的培养基，由STO细胞饲养层和精原干细胞培养液组成，所述精原干细胞培养液包括基础培养基、FBS、氨基酸、LIF、bFGF、IGF-1R激活剂、维生素C、EGF、GDNF。利用本发明的方法和培养基，可使来源于幼体或成体小鼠的精原干细胞均能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定生长的精原干细胞系，并且维持其精子发生的功能。本发明的方法操作简便，安全可靠，成本低廉。
文档编号C12N5/076GK102382799SQ20101026993
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者吴际 申请人:吴际