小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法，将小鼠脂肪干细胞在体外连续传代，然后包括形态学的变化、增殖速度的激增、异常染色体的出现和比例的增加、DNA含量的降低以及表面分子的变化五个步骤。其中形态学和增殖速度的观察与检测可用于初步的判断小鼠脂肪干细胞是否发生了转化；染色体的核型分析从局部水平上来分析小鼠脂肪干细胞染色体是否异常，而DNA含量的分析则从整体水平上来检测核物质的量变，此二法最能说明小鼠脂肪干细胞的转化与否；小鼠脂肪转化后，同时也引起小鼠脂肪干细胞典型分子的表达异常，包括CD44，CD105和Sca-1的变化，反而言之，后期研究中，也可以通过监测这些表面分子的变化来判断小鼠脂肪干细胞的转化，此法则更为简单、直接与有效。
【专利说明】小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]脂肪干细胞具有多向分化的潜能，在体外可定向分化为脂肪、成骨、软骨、肝脏、心肌细胞等，相比于骨髓干细胞，其具有取材容易、获取量大等优点，而且还具有免疫抑制的效应，因此具有重要的意义。
[0003]小鼠作为一个重要的模式动物，在基础研究方面有着广泛的应用，但是脂肪干细胞在体外培养时，其生物学特性很容易发生改变，对于如何有效的鉴定小鼠脂肪干细胞是否发生了自发转化，目前还缺乏全面且典型的检测指标。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法，为小鼠脂肪干细胞转化的鉴定提供全面，简单，有效的检测指标。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法，对小鼠脂肪干细胞分离与培养，将小鼠脂肪干细胞在体外连续传代，同时进行包括以下步骤的操作:
[0006](I)形态学观察:分别观察低代次正常细胞，初见衰老时的细胞和越过衰老后细胞的形态，从形态学上观察越过衰老后细胞是否出现异常；
[0007](2)增殖速度检测:分别绘制低代次正常细胞，初见衰老时的细胞和越过衰老后细胞的生长曲线，计算各自的细胞倍增时间，从增殖速度的角度观察越过衰老后细胞是否出现异常；
[0008](3)染色体形态与数量分析:分别对低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞进行低渗，固定和破核处理，释放出染色体后，用Giemsa染色法，分别对这两种细胞的染色体进行染色，微镜下统计每个细胞染色体的数量以及染色体的形态特征；
[0009](4)DNA的含量分析:分别消化低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞，PI染色后，用流式细胞仪分别检测这两种细胞内DNA的含量，观察越过衰老后的细胞的DNA含量是否有明显的变化；
[0010](5)表面分子的表达:分别消化低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞，分别用针对CD44，CD105和Sca-1的荧光抗体与细胞结合，再用流式细胞仪检测这两种细胞中⑶44，⑶105和Sca-1的阳性率和表达强度，通过其变化来检测小鼠脂肪干细胞是否发生了转化。
[0011]作为优选，上述小鼠脂肪干细胞的分离与培养过程包括以下步骤:
[0012](6)取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；
[0013](7)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入DMEM/F12中洗净血污；
[0014](8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的组成成分为10%胎牛血清(FBS)，0.09%胶原酶 I，余量为 DMEM/F12 ；
[0015](9)消化完后，离心，弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用DMEM/F12重悬底层的细胞；
[0016](10)将细胞悬液依次用孔径为250 μ m和80 μ m的尼龙滤网过滤细胞悬液，收集滤液；
[0017](11)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml碱性成纤维生长因子，50 μ g/ml维生素C的DMEM/F12中连续传代。
[0018]本发明的有益效果是:
[0019]提供了更全面的检测小鼠脂肪干细胞自发转化的指标，研究人员可以根据实际条件选择合适的指标来鉴定细胞，以确保细胞的生物安全性和有效性。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明要解决的技术问题及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0021]一、首先对小鼠脂肪干细胞的分离与培养，包括以下步骤:
[0022](I)取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；
[0023](2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入DMEM/F12中洗净血污；
[0024](3)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的组成成分为10%胎牛血清(FBS)，0.09%胶原酶 I，余量为 DMEM/F12 ；
[0025](4)消化完后，离心，弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用DMEM/F12重悬底层的细胞；
[0026](5)将细胞悬液依次用孔径为250 μ m和80 μ m的尼龙滤网过滤细胞悬液，收集滤液；
[0027](6)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml碱性成纤维生长因子，50 μ g/ml维生素C的DMEM/F12中连续传代。
[0028]二、在上述小鼠脂肪干细胞的分离与培养的基础上，将小鼠脂肪干细胞在体外连续传代，同时进行包括以下步骤的操作:
[0029](7)形态学观察:
[0030]方法:将小鼠脂肪干细胞在体外连续传代，分别观察对比第3代(即低代次状态良好时的小鼠脂肪干细胞)，第23代(即高代次衰老的小鼠脂肪干细胞)，第30代(即高代次越过衰老的小鼠脂肪干细胞)的形态特征。
[0031]结果:发现细胞在第3代的时立体感很强，细胞很细小饱满，典型的成纤维状，说明其状态良好；待其生长至23代时，细胞逐渐拉长，细胞质部分显得宽大，立体感变弱，细胞界限不清晰，说明细胞状态变差；再待其传至第30代，细胞密度较稀时，细胞形态已明显发生了改变，呈现出细长的神经细胞样，待其长满后，则成铺路石状，细胞立体感非常强，细胞间的界限非常明显，说明其状态非常好。
[0032] 细胞在体外随着细胞的传代培养，细胞会逐渐衰老直至死亡，此为正常现象，但是小鼠脂肪干细胞在传代过程中呈现的则是先衰老，状态变差，随着进一步的传代，其又逆转到良好的状态，通过此非正常的变化，可以初步判断小鼠脂肪干细胞已经发生了自发转化。
[0033](8)增殖速度检测:
[0034]方法:将第3代(即低代次状态良好的小鼠脂肪干细胞)和第30代(即越过衰老后的的小鼠脂肪干细胞)分别接种到24孔板中，每孔I万细胞。24h后对每组细胞进行细胞计数，每天3孔，连计数8天，绘制生长曲线，并计算三组细胞的倍增时，以确定其增长速度。
[0035]结果:第3代的细胞生长迅速，细胞倍增的时间为24.2±0.91h ;当细胞传至第16代时，倍增时间延长为36.1±1.81h，说明其增殖速度变慢；待其再传至30代时，细胞的倍增时间为16.2±0.46h，且比第三代的还要短，说明其增殖速度比第3代的还要快。
[0036]细胞随着代次的增加会逐渐衰老，表现在增殖速率上则是生长速度的降低。但是小鼠脂肪干细胞随着代次的进一步增加，反而增殖速度会进一步的提高，预示着细胞可能出现了异常，亦可作为一个初步判断细胞自发转化的指标。
[0037](9)染色体核型分析
[0038]方法:分别将第3代(即低代次状态良好的小鼠脂肪干细胞)和第30代(即越过衰老后的的小鼠脂肪干细胞)用0.1 μ g/ml秋水仙素37度处理2小时，再用胰酶消化细胞，然后用0.075M KCL37度低渗处理细胞30min。低渗结束后，1200rpm离心1min细胞，再弃去上清液，加入4ml的固定液固定30min，重复2次。最后一次离心后弃上清，滴片，最后Giemsa染色,显微镜下观察。
[0039]结果:发现细胞传至30代，小鼠脂肪干细胞的染色体出现了单倍体，三倍体，断裂和融合这些异常的核型，且这些异常染色体的比例将近95%。而第三代的脂肪干细胞核型基本正常，且异常染色体的比例仅为8%，由此可以从局部水平上说明细胞发生了自发转化。
[0040](10) DNA 含量分析
[0041]方法:分别消化第3代(即低代次状态良好的小鼠脂肪干细胞)、第16代(初见衰老后的小鼠脂肪干细胞)和第30代(即越过衰老后的的小鼠脂肪干细胞)，用碘化丙啶染色15min，使其与DNA充分结合；之后再用I %的多聚甲醛固定15min以固定细胞的形态，用流式细胞仪检测两组细胞的DNA含量。
[0042]结果:相比于第3代的小鼠脂肪干细胞，第30代细胞的DNA指数仅为0.84，显著的低于第3代的细胞，说明第30代的细胞的DNA含量已经明显的减少，从而在DNA整体水平上确定小鼠脂肪干细胞确实已经发生了自发转化。
[0043](11)表面分子的分析
[0044]方法:用tryple分别消化第3代(即低代次状态良好的小鼠脂肪干细胞)和第30代(即越过衰老后的的小鼠脂肪干细胞)，分别用⑶44，⑶105和Sca-1的荧光直标单抗与之冰上共孵育30min，使抗体与细胞充分结合。孵育结束后，用预冷的杜氏磷酸盐缓冲液洗漆3遍,充分洗去未结合的抗体。最后一次洗漆离心后,用1%的多聚甲醒固定30min,再用流式细胞仪检测这两种代次细胞⑶44，⑶105和Sca-1的表达情况。
[0045] 结果:与第3代的小鼠脂肪干细胞相比，细胞传至30代。⑶44表达的阳性率不会有明显的改变，但是Sca-1的表达率会极显著的升高，而CD105则完全不表达。对于阳性表达的⑶44与Sca-1，与第三代的小鼠脂肪干细胞相比，第30代的细胞⑶44的平均表达水平极显著的降低，而Sca-1的平均表达水平则极显著的升高。因此可以Sca-1阳性率及阳性表达水平的显著升高，⑶44平均表达水平的降低，以及⑶105表达的消失为指标来确定细胞发生了自发转化。
[0046]本实施例所述的小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法具有以下特点:
[0047]1.从小鼠脂肪干细胞的状态的由好变差，然后再变好的异常变化来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0048]2.从小鼠脂肪干细胞的增殖速度由快变慢，再显著加快的异常变化来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0049]3.通过染色体的核型分析，观察染色体的异常变化，从局部水平上来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0050]4.通过DNA含量的分析，从整体水平上判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。[0051 ] 5.通过⑶44阳性的小鼠脂肪干细胞⑶44平均表达水平的显著降低来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0052]6.通过小鼠脂肪干细胞Sca-1的阳性率降低来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0053]7.通过Sca-1阳性的小鼠脂肪干细胞Sca-1平均表达水平的显著升高来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0054]8.通过小鼠脂肪干细胞⑶105表达的消失来判断小鼠脂肪干细胞发生了自发转化。
[0055]本实施例建立了一套全面检测小鼠脂肪干细胞自发转化的方法，包括形态学的变化，增殖速度的激增，异常染色体的出现和比例的增加，DNA含量的降低以及表面分子的变化。其中形态学和增殖速度的观察与检测可用于初步的判断小鼠脂肪干细胞是否发生了转化，操作起来简单易行；染色体的核型分析从局部水平上来分析小鼠脂肪干细胞染色体是否异常，而DNA含量的分析则从整体水平上来检测核物质的量变，此二法操作起来较复杂，却最能说明小鼠脂肪干细胞的转化与否。小鼠脂肪转化后，同时也引起小鼠脂肪干细胞典型分子的表达异常，包括⑶44，⑶105和Sca-1的变化，反而言之，后期研究中，也可以通过监测这些表面分子的变化来判断小鼠脂肪干细胞的转化，此法则更为简单，直接与有效。
[0056]以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【权利要求】
1.小鼠脂肪干细胞自发转化的鉴定方法，其特征在于:对小鼠脂肪干细胞分离与培养，将小鼠脂肪干细胞在体外连续传代，同时进行包括以下步骤的操作: (1)形态学观察:分别观察低代次正常细胞，初见衰老时的细胞和越过衰老后细胞的形态，从形态学上观察越过衰老后细胞是否出现异常； (2)增殖速度检测:分别绘制低代次正常细胞，初见衰老时的细胞和越过衰老后细胞的生长曲线，计算各自的细胞倍增时间，从增殖速度的角度观察越过衰老后细胞是否出现异常； (3)染色体形态与数量分析:分别对低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞进行低渗，固定和破核处理，释放出染色体后，用Giemsa染色法，分别对这两种细胞的染色体进行染色，显微镜下统计每个细胞染色体的数量以及染色体的形态特征； (4)DNA的含量分析:分别消化低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞，PI染色后，用流式细胞仪分别检测这两种细胞内DNA的含量，观察越过衰老后的细胞的DNA含量是否有明显的变化； (5)表面分子的表达:分别消化低代次的正常细胞和越过衰老后的细胞，分别用针对⑶44，⑶105和Sca-1的荧光抗体与细胞结合，再用流式细胞仪检测这两种细胞中⑶44，⑶105和Sca-1的阳性率和表达强度，通过其变化来检测小鼠脂肪干细胞是否发生了转化。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:所述小鼠脂肪干细胞的分离与培养包括以下步骤: (6)取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒； (7)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入DMEM/F12中洗净血污； (8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的组成成分为10%胎牛血清(FBS)，.0.09%胶原酶I，余量为DMEM/F12 ； (9)消化完后，离心，弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用DMEM/F12重悬底层的细胞； (10)将细胞悬液依次用孔径为250μ m和80 μ m的尼龙滤网过滤细胞悬液，收集滤液； (11)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml碱性成纤维生长因子，50μδ/πι1维生素C的DMEM/F12中连续传代。
【文档编号】C12Q1/04GK104073466SQ201410000495
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】张运海, 魏超, 李运生, 章孝荣, 方富贵, 张鹏飞, 李侠, 姜少帅, 韩菲, 宋丹丹, 刘通 申请人:安徽农业大学