小鼠胚胎肝基质细胞km3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途
【专利摘要】本发明涉及小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。具体是KM3细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处理2h后，在液氮中冻存60d，复苏后细胞可作为人胚胎干细胞传代培养的饲养层细胞，支持人胚胎干细胞稳定传代。
【专利说明】小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及小鼠胚胎肝基质细胞KM3的新用途，是经处理后直接可用作人胚胎干细胞稳定传代培养的饲养层细胞。
【背景技术】
[0002]人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)培养体系依据是否使用饲养层可分为两种，一种是饲养层培养体系，另一种是无饲养层培养体系。无饲养层培养体系中需添加各种细胞因子，试剂价格相对昂贵，稳定传代还有待观察，所以在大规模培养hESCs性价比并不高。饲养层培养体系是普遍采用的方法，小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)是最经典和最常用的饲养层细胞，但其制备过程繁琐，细胞增殖有限，5-6代后就不宜再作为饲养层。我们从小鼠胚胎肝中得到了一株永生化小鼠胚胎肝基质细胞系(命名为KM3)，其可以支持hESCs的稳定生长和传代[Jiabo Hu, Sanqiang Hu, Quanhui Ma, Xiaohui Wang, Zhongwei Zhou, Wei Zhang, XiaochunSun, Wei Zhu, HuiQian, WenrongXu.1mmortalized mousefetal liver stromal cellssupport growth and maintenance of human embryonic stem cells, OncologyReports, 2012，28 (5): 1385-1391.】，但在人胚胎干细胞培养过程中，需要不断传代维持新鲜KM3，费时，费力，影响因素多。我们的目的就是制备一种可以保存并且可以即时利用的hESCs饲养层细胞。
【发明内容】
[0003]为了保证人胚胎干细胞的稳定连续培养，本发明提供一种可用于人胚胎干细胞传代培养的饲养层细胞，使人胚胎干细胞的培养更高效、简便和经济。
[0004]本发明选择适合的丝裂霉素C浓度，在适合的丝裂霉素C浓度下，处理KM3细胞，将处理后的细胞在液氮中冻存60d之后对其进行复苏。复苏后的细胞形态学与新鲜处理的细胞未见明显的差别，可以支持人胚胎干细胞的稳定传代。
[0005]本发明公开了小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。
[0006]具体地，KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞可直接作为人胚胎干细胞的饲养层使用。
[0007] 本发明还提供了一种人胚胎干细胞饲养层的制备方法，是将KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞作为人胚胎干细胞的饲养层。
[0008]具体地，当KM3细胞融合度达到80%_90%时，细胞经过10 μ g/ml的丝裂霉素C处
[0009]理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，即得到人胚胎干细胞的饲养层。
[0010]本发明有益效果是:丝裂霉素C处理的KM3细胞冻存60d后可以直接作为饲养层细胞支持人胚胎干细胞稳定传代。【专利附图】
【附图说明】
[0011]下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。
[0012]图1是KM3饲养层细胞经过10 μ g/ml丝裂霉素C处理。
[0013]图2是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞HE染色。
[0014]图3是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞培养7天之后生长状态。
[0015]图4是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层支持人胚胎干细胞生长情况。
【具体实施方式】
[0016]实施例:
[0017]实验方法
[0018]1.KM3细胞冻存25cm2培养瓶内KM3细胞培养至80%_90%融合时，弃掉营养液，加入2ml浓度为10 μ g/ml的丝裂霉素C处理，置37°C培养箱2h。弃丝裂霉素C，用PBS洗5次，每次2min。0.25%胰酶消化lmin, 800rpm离心5min,弃上清，收集KM3细胞,将预先配好的冻存液(FBS:DMS0=9:1 )7.5ml加入收集的KM3细胞管中，混匀，冻存管分装(分装5管，每管1.5ml)，程序降 温，4°C 30min, -20°C 2h，_70°C过夜，然后于液氮中冻存60d。
[0019]2.KM3细胞复苏以及台盼蓝染色60d之后，从液氮中取出冻存管，立即将其置于37°C水浴中，不断摇匀，待融化后，将其吸入到预先加入2ml的离心管中，混匀，继续加
6.5mllO%NBS DMEM，补足至 10ml,混匀，800rpm离心 5min，弃上清，加 lmllO%NBS DMEM重悬，取90ul细胞悬液与IOul0.4%台盼蓝溶液充分混匀，充入计数板，在三分钟内计数蓝色和未染蓝色的细胞，共计数500个细胞，重复三次，拒染率(％)=拒染细胞数/细胞总数χ100%，以拒染的4.0xlO5个/孔KM3细胞种入6孔板中，置37°C，5%C02培养箱过夜。
[0020]3.HE染色复苏后的细胞培养至第四天的时候进行HE染色:取出细胞爬片，细胞面朝上，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20min，蒸馏水洗3次，每次5min，苏木素染色6min，用自来水洗去多余染料，1%盐酸酒精分色2s，自来水洗30s，蒸馏水过洗2s，0.5%伊红染液染色2min，自来水冲洗多余染料，室温干燥，油镜拍照。
[0021]4.人胚胎干细胞传代以及碱磷酶染色取出温箱中的hESCs，慢慢吸掉培养瓶中的营养液，加lmg/ml IV胶原酶2ml，以覆盖细胞为宜，置37°C培养箱消化。待40min时镜下观察，见hESC团块边缘卷起时(可有部分团块脱落，同时也可见部分细胞团未卷边)将IV型胶原酶吸出，加 2ml hESCs 培养液[20%Knockout SR, 78%Knockout DMEM, 1% 非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺+ β -巯基乙醇(称取0.073g L-谷氨酰胺用PBS完全溶解至5ml，再加入
3.5ul β -巯基乙醇混匀后用0.22 μ m无菌小滤器过滤备用),b_FGF4ng/ml]于培养瓶中，用滴管轻轻吹打，将hESCs细胞团吹打起，将细胞悬液吸入另一离心管中，重复2次，镜下观察有无hESCs细胞团，若hESCs细胞团多，则可用IV型胶原酶按上述方法再消化I次。hESCs细胞悬液静置5min后，用滴管将上清尽量吸出弃掉，再加2ml hESCs培养液后重悬，自然沉降5min，弃上清。加2ml hESCs培养液后重悬，用滴管吹打，将hESCs细胞团吹打成小细胞团(切勿将细胞团吹太小，否则细胞团不易长大成团)。在hESCs传代前，吸掉6孔板中的培养液，加入hESCs培养液2ml，将hESCs以1:8的比例种入6孔板中，镜下观察hESCs细胞团大小，混匀，让细胞团分布均匀。37°C，5%C02培养箱中培养48h后换液，以后每天换液I次，4d传代I次。共连续传代5次，每次传代方法相同，以丝裂霉素C处理但未冻存的KM3为对照。第5代时进行碱性磷酸酶染色，按照试剂盒操作(试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司)。
[0022]实验结果:
[0023]1、KM3饲养层细胞经10 μ g/ml丝裂霉素C处理2h时后，Id的形态见图lA，2d的形态见图1B，3d的形态见图1C，7d的形态见图1D，可稳定维持7天。
[0024]2、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞的HE染色(油镜)，见图2A ；KM3饲养层细胞经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，饲养层细胞的HE染色(油镜)，见图2B。两种饲养层细胞形态未见明显区别，细胞胞体呈长梭形，胞浆呈红色，胞质颗粒较少，核呈蓝色，椭圆形，核膜清晰。
[0025]3、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞连续培养7d的细胞形态，见图3A。KM3经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，作为人胚胎干细胞饲养层细胞连续培养7d的细胞形态，见图3B。两种饲养层细胞形态变化不明显，呈长梭形，略有不规则。
[0026]4、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞，人胚胎干细胞在饲养层的形态，见图4A，碱磷酶染色见图4C。KM3经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，人胚胎干细胞在饲养层的形态，见图4B，磷酶染色见图4D。饲养层上面的团块生长状态良好，呈鸟巢状，排列紧密，与饲养层细胞界限明显，单个细胞体积较小，核大，胞质少，核质比高，核仁明显，碱磷酶染色呈阳性，两者未`见明显差异。
【权利要求】
1.小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞可直接作为人胚胎干细胞的饲养层使用。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10μ g/ml的丝裂霉素C处理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，均可支持人胚胎干细胞的生长。
4.一种人胚胎干细胞饲养层的制备方法，其特征在于，将KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞作为人胚胎干细胞的饲养层。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10 μ g/ml的丝裂霉素C处理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，即得到人胚胎干细胞的饲 养层。
【文档编号】C12N5/0735GK103710301SQ201310718153
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】胡嘉波, 张微, 麻全慧, 胡三强, 徐虹 申请人:江苏大学