一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种诱导小鼠胚胎干细胞分化获得内耳毛细胞的方法，首先用条件培养液和诱导培养液诱导胚胎干细胞分化毛细胞前体细胞；然后利用诱导培养液与滋养层细胞结合的方法诱导前体细胞分化成熟内耳毛细胞；本发明所述方法能够有效诱导胚胎干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞和成熟内耳毛细胞，分化比率高，分化所得细胞表达毛细胞特异基因和蛋白，并具备一定毛细胞电生理功能。
【专利说明】一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种内耳毛细胞的分化方法，特别涉及一种诱导小鼠胚胎干细胞分化 获得内耳毛细胞的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 听力损失是严重影响人类生活质量的世界性顽疾之一，目前尚无根治方法。哺乳 动物内耳毛细胞的不可修复损伤被认为是导致听力损失的最主要原因之一。传统观点认 为，人类内耳听觉毛细胞为特化终末细胞，不再具有再生修复能力，其损伤是不可逆的。近 年来研究发现哺乳动物胚胎期或早期毛细胞有可能再生，并且通过转染促毛细胞分化发育 相关基因在成年耳蜗中发现不成熟毛细胞的异位发生，提示了哺乳动物毛细胞在一定诱导 条件下实现再生的可能性，但对于病变过程中毛细胞的修复再生仍存在很大挑战。因此寻 找毛细胞再生的前体细胞来源，以便开发毛细胞损伤修复干预策略是听力损失治疗的当务 之急。
[0003] 干细胞以其全能或多能性以及高度的自我增殖能力等诸多优点而成为组织工程 和细胞治疗领域研究的热点。近年来越来越多研究展示了胚胎干细胞和各种来源的成体 干细胞在组织损伤修复和疾病治疗研究中的极大优势和应用潜能，以干细胞诱导分化为基 础，利用干细胞相关技术，探讨听觉系统损伤修复特别是毛细胞的损伤和再生已成为可能。 同时，由于毛细胞数量稀少，对于毛细胞发育的分子机制研究仍然非常有限。因此，探索建 立有效的干细胞分化毛细胞诱导体系，不仅能为毛细胞再生治疗提供有效细胞来源，而且 将为探讨毛细胞分化发育相关分子和信号机制提供研究模型。胚胎干细胞具有体外培养无 限增殖、自我更新和分化全能性等优点，是干细胞分化领域的重点。本发明利用胚胎干细 胞，建立了一种条件培养液、细胞因子和滋养层细胞相结合有效诱导分化内耳毛细胞的方 法。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种诱导小鼠胚胎干细胞分化获得内耳毛细胞的方法，本发明 方法首先用条件培养液和诱导培养液诱导胚胎干细胞分化毛细胞前体细胞；然后利用诱导 培养液与滋养层细胞（即鸡胚椭圆囊间质细胞）结合的方法诱导前体细胞分化成熟内耳毛 细胞，通过本方法诱导，能够得到高比例的毛细胞前体细胞和成熟内耳毛细胞。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，所述的方法为：（1) 将小鼠胚胎干细胞接种至条件培养液，在37°C、5% CO2条件下培养4-5天，形成细胞团；取 细胞团转移至诱导液I中，在37°C、5% CO2条件诱导培养12-14天，获得胚胎干细胞分化 的毛细胞前体细胞；所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度30-50% HepG2条件培养液、 ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10% FBS(胎牛血清）， 溶剂为DMEM/F12基础培养液；所述H印G2条件培养液按如下方法制备：将H印G2细胞以 5X 104cellS/cm2密度接种于培养皿中，按I. 75X 105cellS/mL培养液的量加入含体积终浓 度10% FBS的DMEM培养液，置于37°C、5% CO2条件下培养4-5天后收集上层培养液，离心除 去细胞碎片，获得上层清液和下层沉淀，弃去下层沉淀，取上层清液经抽滤（优选〇. 22 μ m 滤膜抽滤），滤液即为HepG2条件培养液；所述诱导液I终浓度组成为：体积浓度5 % FBS、 5-15ng/ml IGF-I (胰岛素样生长因子-l)、20-30ng/ml EGF(表皮细胞生长因子）、1XN2、 lXB27、45-55ng/mL FGF3(成纤维细胞生长因子3)、45-55ng/mL FGFlO(成纤维细胞生长因 子10)、45-55ng/mL肝素钠，溶剂为DMEM/F12基础培养液；
[0007] (2)将鸡胚椭圆囊间质细胞（优选生长至90%汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞）用 含终浓度2 μ g/ml丝裂霉素 C的DMEM培养液浸泡，在37°C，5% CO2培养箱中培养3小时， 弃去培养液，细胞用pH值为7. 4的PBS缓冲液洗涤，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞；
[0008] (3)将步骤⑴获得的毛细胞前体细胞进行消化处理，静置沉淀，弃沉淀，将细胞 悬液接种（优选将细胞悬液以IO 5个/cm2的密度接种）至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞 上，加入诱导液II，在37°C，5% CO2培养箱中继续诱导3-4周，获得含内耳毛细胞的培养液， 收集内耳毛细胞；所述诱导液II终浓度组成：体积浓度5% FBS、20-30ng/ml EGF、1XN2、 1ΧΒ27、5-15μΜ RA(全反式维甲酸）、5μΜ氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰）-1^-丙氨酰]-5-苯 基甘氨酸丁酯（DAPT)，溶剂为DMEM/F12基础培养液。
[0009] 进一步，优选所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度40% HepG2条件培养液、 ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ -巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10% FBS，溶剂为DMEM/ F12基础培养液。
[0010] 进一步，优选所述诱导液I终浓度组成为：体积浓度5% FBS、10ng/mlIGF-l、 25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素钠，溶剂为DMEM/ F12基础培养液。
[0011] 进一步，本发明所述鸡胚椭圆囊间质细胞即为滋养层细胞，制备方法主要通过消 化和传代方法从受精18天鸡胚中分离培养椭圆囊间质细胞，第3-5代细胞，经丝裂霉素 C 处理后，作为滋养层细胞，具体所述鸡胚椭圆囊间质细胞按如下方法制备：从受精18天鸡 胚中分离椭圆囊，0. 25%胰酶，37°C消化15-20分钟后，用体积终浓度10% FBS+DMEM培养 液中止，过200目筛网，收集细胞悬液，lOOOrpm/min离心6-8分钟，细胞用体积终浓度10% FBS+DMEM培养液悬浮，接种于培养瓶中，置37°C，5 % CO2培养箱培养，48小时后首次换液， 弃去未贴壁细胞，贴壁继续培养至90%汇合度，用0. 25%胰酶/EDTA消化并接种至细胞培 养瓶培养，记为Pl代细胞，通过如此传代培养，至P3代，即得到形鸡胚椭圆囊间质细胞。
[0012] 进一步，优选所述毛细胞前体细胞用accutase进行消化处理。
[0013] 进一步，优选所述诱导液II终浓度组成：体积浓度5% FBS、25ng/mlEGF、lXN2、 1ΧΒ27、10μΜ RA、5yM DAPT，溶剂为 DMEM/F12 基础培养液。
[0014] 更进一步，所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法推荐按如下步骤进 行：（1)将小鼠胚胎干细胞ES-D3接种至含质量浓度1%琼脂（即琼脂用水溶解制成质量 浓度1%琼脂溶液，然后倒平板）的培养板上，加入条件培养液，在37°C、5% CO2条件下培 养4-5天，每天换液；取细胞团转移至培养孔板内，加入诱导液I，在37°C、5% CO2条件诱 导培养12-14天，每天换液，获得胚胎干细胞分化的毛细胞前体细胞；所述条件培养液终 浓度组成为：体积浓度40% !fepG2条件培养液、ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ -巯基乙醇、2mM GlutaMAX、10% FBS，溶剂为DMEM/F12基础培养液；所述H印G2条件培养液按如下方法制 备：将H印G2细胞以5X104cells/cm2密度接种于培养皿中，按I. 75X 105cells/mL培养液 的量加入含体积终浓度10% FBS的DMEM培养液，置于37°C、5% CO2条件下培养4-5天后 收集上层培养液，离心除去细胞碎片，上层清液经0. 22 μ m滤膜抽滤，滤液即为HepG2条 件培养液；所述诱导液I终浓度组成为：体积浓度5% FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/ml EGF、 lXN2、lXB27、50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL 肝素钠，溶剂为 DMEM/F12 基础培养 液；
[0015] (2)将生长至90%汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度2 μ g/ml丝裂霉素 C 的DMEM培养液浸泡，在37°C，5% CO2培养箱中培养3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7. 4 的PBS缓冲液洗涤，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞；
[0016] (3)用accutase消化步骤（1)获得的毛细胞前体细胞,静置沉淀除去未分散的 细胞团块，弃沉淀，将细胞悬液接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上，加入诱导液Π ， 在37°C，5% CO2培养箱中继续诱导3-4周，获得含内耳毛细胞的培养液，收集内耳毛细胞； 所述诱导液II终浓度组成：体积浓度5% FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10yM RA、5yM DAPT，溶剂为DMEM/F12基础培养液。
[0017] 本发明中所述培养液及诱导液中的因子均可通过市购方式获得，DMEM/F12基础培 养液优选购自Corning公司，I XN2和I XB27均购自Invitrogen，所述受精18天鸡胚购自 杭州天源养殖有限公司。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述方法能够有效诱导 胚胎干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞和成熟内耳毛细胞，分化所得细胞表达毛细胞特异 基因和蛋白，并具备一定毛细胞电生理功能。且通过本方法诱导能够获得更高比例的内耳 毛细胞前体细胞核成熟内耳毛细胞。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1毛细胞前体细胞标志基因检测图；图1中ES表示未诱导分化的胚胎干细胞， progenitor表示胚胎干细胞分化所得毛细胞前体细胞，β -actin作为内参。
[0020] 图2毛细胞前体细胞蛋白免疫荧光检测图；Al为Pax2表达，A2为Pax8表达，A3为 细胞核（DAPI染色），A4为A1、A2和A3三幅图的叠加；Bl为Atohl表达，B2为Pax2表达， B3为细胞核（DAPI染色），B4为B1、B2和B3三幅图的叠加；Cl为Atohl表达，C2为Brn3C 表达，C3为细胞核（DAPI染色），C4为Cl、C2和C3三幅图的叠加。
[0021] 图3成熟毛细胞蛋白免疫荧光检测图；Al为Espin和细胞核C23表达，A2为 F-actin和细胞核C23表达，A3为Al和A2两幅图的叠加；Bl为Espin和细胞核C23表达， B2为Myosin W a和细胞核C23表达，B3为Bl和B2两幅图的叠加；Cl为FM1-43FX染色和 细胞核C23表达，C2为Myosin W a和细胞核C23表达，C3为Cl和C2两幅图的叠加。 (五）
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 实施例1 :条件培养液和因子组合的方法诱导胚胎干细胞分化毛细胞前体细胞
[0024] 将小鼠胚胎干细胞ES-D3 (购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞 生物学研究所）传代后接于预铺质量浓度1 %琼脂的培养板上，加入条件培养液在37°C、 5% CO2条件培养4-5天，每天换液。然后将细胞团转移至12孔板内，每孔约30个，换诱导 液I，在37°C、5% CO2条件诱导培养12-14天，每天换液，获得胚胎干细胞分化的毛细胞前 体细胞。
[0025] 条件培养液终浓度组成：体积浓度40 % H印G2条件培养液、ImM非必需氨基酸（购 自Gibco公司，编号：11140-050)、5μ Mβ-巯基乙醇（购自Gibco公司）、2mM L-谷氨酰胺 (购自Gibco公司）、体积浓度10% FBS，溶剂为DMEM/F12基础培养液（购自Corning公 司）。
[0026] HepG2条件培养液的制备：将HepG2细胞（购自中国科学院上海生命科学 研究院生物化学与细胞生物学研究所）以5X10 4cellS/cm2密度接种于培养皿中，按 I. 75X 105cells/mL培养液的量加入含体积终浓度10% FBS(购自Gibco公司）的DMEM培 养液（购自Corning公司），置于37°C、5% CO2条件下培养4-5天后收集上层培养液，离心 除去细胞碎片，上层清液经〇. 22 μ m滤膜抽滤，滤液即为HepG2条件培养液。
[0027] 诱导液I终浓度组成：体积浓度5 % FBS、10ng/ml IGF-I (购自P印rotech公 司）、25ng/ml EGF(购自 Peprotech 公司）、1XN2(购自 Invitrogen)、lXB27(购自 Invitrogen)、50ng/mL FGF3 (购自 R&D 公司）、50ng/mL FGFlO (购自 R&D 公司）、50ng/mL 肝 素钠（购自Sigma公司），溶剂为DMEM/F12基础培养液（购自Corning公司）。
[0028] 实施例2 :鸡胚椭圆囊间质细胞的分离
[0029] 从受精18天鸡胚（购自杭州天源养殖有限公司）中分离椭圆囊，0· 25%胰酶（购 自Corning公司），37°C消化15-20分钟后，用DMEM培养液（添加体积终浓度10% FBS)中 止，过200目筛网，收集细胞悬液，lOOOrpm/min离心6-8分钟，细胞用DMEM培养液（添加体 积终浓度10% FBS)悬浮，接种于培养瓶中，置37°C，5% CO2培养箱培养，48小时后首次换 液，弃去未贴壁细胞，贴壁继续培养至90%汇合度，用0. 25%胰酶/EDTA(购自Corning公 司）消化并接种至细胞培养瓶培养，记为Pl代细胞，通过如此传代培养，至P3代，即得到形 态单一的鸡胚椭圆囊间质细胞。
[0030] 实施例3 :因子组合与滋养层细胞结合的方法诱导前体细胞分化成熟内耳毛细胞
[0031] 首先将实施例2制备的生长至90 %汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度 2 μ g/ml丝裂霉素 C (购自Sigma公司）的DMEM培养液浸泡，在37°C，5% CO2培养箱中培养 3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7. 4的PBS缓冲液（购自生工生物公司）洗涤，除去洗 涤液，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞。
[0032] 用accutase (购自Gibco公司）消化实施例1诱导分化的毛细胞前体细胞，稍静 置沉淀除去未分散的细胞团块，将细胞悬液以IO5个/cm 2的密度接种至预处理后的鸡胚椭 圆囊间质细胞上，加入诱导液II，在37°C，5% CO2培养箱中继续诱导3-4周，收集诱导细胞 进行鉴定，获得成熟内耳毛细胞。
[0033] 诱导液II终浓度组成：体积浓度 5% FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10yM RA、 5 μ M DAPT (购自Sigma公司），溶剂为DMEM/F12基础培养液。
[0034] 实施例4 :分化细胞的鉴定
[0035] (1)毛细胞前体细胞特异基因检测：取实施例1获得的前体细胞用TRizol (购自 Invetigen)提取总RNA，提取方法按说明书进行，然后用逆转录试剂盒RNA PCR kit(AMV) Ver3. O (购自TaKaRa公司）进行逆转录。以逆转录得到的cDNA为模板，分别在引物Pax2、 Pax8、Dlx5、Eyal、Sixl、Atohl 和 Brn3c 作用下进行 PCR 反应，检测 Pax2、Pax8、Dlx5、Eyal、 SixUAtohl和fcn3c基因表达，β-actin作为内参。PCR程序为：94°C预变性5min，94°C变 性308,501：?651：退火308,721：延伸308，共30?40个循环，721：延伸101^11，退火温度 和循环数根据引物的具体情况进行选择。分别将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 同时以小鼠胚胎干细胞ES-D3作为对照，结果见图1所示。
[0036] 所用引物（均由上海捷瑞生物公司合成）如下：
[0037] Pax2(5,-CGAATACAAGCGACAGAACC-3,，5,-GGGACAGAGCCCTCAGACA-3'）；
[0038] Pax8 (5,-GCAGAAGGCGTTTGTGAC-3'，5'-GAGCCCGTTGATAGAGTAGG-3'）；
[0039] Dlx5 (5,-GCCAAGGCTTATGCCGACTA-3,，5,-TTCTGGCAGGGCGAGGTAC-3'）；
[0040] Eyal (5,-GTCCACCAATGCCACTTA-3'，5'-AGGTCCCAGATGAACACT-3'）；
[0041] Sixl(5,-CCTCCTCCAACAAGCAGAATC-3'，5'-GGAACCCAAGTCCACCAA-3'）；
[0042] Atohl (5,-GCTCCCTGAAAACTGAGACAACCAA-3'，5'-ATGAAGTGCGTGTATTCTGGGTCC G-3,）；
[0043] Brn3c (5,-AGCCTACACTCCGGCTCTGAG-3,，5,-TGACTCCACATCGCTGAGACACG-3,）；
[0044] β -actin (5,-ACACCTTCTACAATGAGCTG-3'，
[0045] 5'-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3'）。
[0046] (2)毛细胞前体细胞免疫荧光检测：取实施例I获得的前体细胞，经4%多聚甲醛 室温固定15min后，用pH值7. 4的PBS漂洗除去多聚甲醛，再用0.05% Triton X-100 (购 自Sigma公司）室温（25°C)孵育lOmin，然后用5%山羊血清（购自生工生物）在室温封闭 lh，PBS清洗两次，将细胞分成3组，分别加入一抗，组1为抗Pax2和Pax8、组2为抗Atohl 和Pax2、组3为Atohl和Brn3c，一抗均购自Santa cruz公司，4°C湿盒孵育过夜；PBS浸洗三 次，每次IOmin ;依次加入二抗，组1加入Alexa488和Dylight649标记、组2加入Alexa488 和Alexa647标记、组3加入Alexa488和Dylight649标记，二抗均购自联科生物公司，37°C 孵育lh，PBS浸洗三次；DAPI (购自Sigma公司）染核，激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss)观 察拍照。结果见图2所示。
[0047] (3)成熟毛细胞特异蛋白免疫荧光检测：取实施例3获得的诱导细胞，经4%多 聚甲醛室温固定15min后，用pH值7. 4的PBS漂洗除去多聚甲醛，再用0.05% Triton X-100(购自Sigma公司）室温（25°C )孵育lOmin，然后用5%山羊血清（购自生工生物） 在室温封闭lh，PBS清洗两次，分成3组，分别加入一抗，组1为抗Espin和C23,组2为抗 Espin、组3为Myosin7a和C23, 一抗均购自Santa cruz公司，4°C湿盒孵育过夜；PBS浸洗三 次，每次IOmin ;依次加入二抗，组1加入Alexa488和Dylight405标记，组2加入Alexa488、 组3加入Dylight649和Dylight405标记，二抗均购自联科生物公司，37°C孵育lh，PBS浸 洗三次，激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss)观察拍照。其中Espin和C23检测组二抗孵育完 成并PBS浸洗后，用TRITC偶联的鬼笔环肽（购自Invitrogen公司）标记F-actin，而后进 行激光共聚焦显微镜观察拍照。在二抗之后37°C孵育Ih直接标记。结果见图3所示。
[0048] 毛细胞电生理功能检测：利用FM1-43FX (购自Invitrogen公司）染色实验检测诱 导细胞电生理功能，诱导细胞用HBSS(购自生工生物公司）清洗后，加入5μΜ FM1-43FX室 温孵育30s，立即用HBSS清洗，再用HBSS浸洗20min后进行免疫荧光实验检测Myosin7a， 步骤和抗体如实施例4-(3)中所述。结果见图3所示。
[0049] 结果表明，诱导所得分化细胞能够表达毛细胞前体细胞特异基因、前体细胞和成 熟毛细胞特异性蛋白，并具有一定的毛细胞电生理功能，表明本发明方法能够有效诱导胚 胎干细胞分化内耳毛细胞。
[0050] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述的方法为：（1) 将小鼠胚胎干细胞接种至条件培养液，在37°C、5 % C02条件下培养4-5天，形成细胞团；取 细胞团转移至诱导液I中，在37°C、5% C02条件诱导培养12-14天，获得胚胎干细胞分化的 毛细胞前体细胞；所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度30-50 % H印G2条件培养液、ImM 非必需氨基酸、5uMP -巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10 % FBS，溶剂为DMEM/F12基 础培养液；所述H印G2条件培养液按如下方法制备：将H印G2细胞以5X 104cellS/cm2密度 接种于培养皿中，按1. 75X 105cellS/mL培养液的量加入含体积浓度10% FBS的DMEM培养 液，置于37°C、5% C02条件下培养4-5天后收集上层培养液，离心，取上层清液经抽滤，滤液 即为H印G2条件培养液；所述诱导液I终浓度组成为：体积浓度5%FBS、5-15ng/ml IGF-1、 20-30ng/ml EGF、lXN2、lXB27、45-55ng/mL FGF3、45-55ng/mL FGF10、45-55ng/mL 肝素 钠，溶剂为DMEM/F12基础培养液； (2) 将鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度2 y g/ml丝裂霉素C的DMEM培养液浸泡，在 37°C，5% C02培养箱中培养3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7. 4的PBS缓冲液洗涤，即 为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞； (3) 将步骤（1)获得的毛细胞前体细胞进行消化处理，静置沉淀，弃沉淀，将细胞悬液 接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上，加入诱导液II，在37°C，5% C02培养箱中继续 诱导3-4周，获得分化成熟的内耳毛细胞；所述诱导液II终浓度组成：体积浓度5% FBS、 20-30ng/ml EGF、lXN2、lXB27、5-15iiM RA、5iiM DAPT，溶剂为 DMEM/F12 基础培养液。
2. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述条 件培养液终浓度组成为：体积浓度40% IfepG2条件培养液、ImM非必需氨基酸、5 y MP -巯 基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10% FBS，溶剂为DMEM/F12基础培养液。
3. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述 诱导液 I 终浓度组成为：体积浓度 5% FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/mlEGF、lXN2、lXB27、 50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL 肝素钠，溶剂为 DMEM/F12 基础培养液。
4. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述 鸡胚椭圆囊间质细胞按如下方法制备：从受精18天鸡胚中分离椭圆囊，0.25%胰酶，37°C 消化15-20分钟后，用体积终浓度10% FBS+DMEM培养液中止，过200目筛网，收集细胞悬 液，1000rpm/min离心6-8分钟，细胞用体积终浓度10% FBS+DMEM培养液悬浮，接种于培养 瓶中，置37°C，5% C02培养箱培养，48小时后首次换液，弃去未贴壁细胞，贴壁继续培养至 90%汇合度，用0. 25%胰酶/EDTA消化并接种至细胞培养瓶中培养，记为P1代细胞，通过如 此传代培养，至P3代，即得到鸡胚椭圆囊间质细胞。
5. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述毛 细胞前体细胞用accutase进行消化处理。
6. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述诱 导液II终浓度组成：体积浓度 5%FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10iiM RA、5iiM DAPT， 溶剂为DMEM/F12基础培养液。
7. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于步骤 (3)所述细胞悬液以105个/cm2的密度接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上。
8. 如权利要求1所述诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述的 方法按如下步骤进行：（1)将小鼠胚胎干细胞ES-D3接种至含质量浓度1%琼脂的培养板 上，加入条件培养液，在37°C、5% C02条件下培养4-5天，每天换液；取细胞团转移至培养 孔板内，加入诱导液I，在37°C、5% C02条件诱导培养12-14天，每天换液，获得胚胎干细胞 分化的毛细胞前体细胞；所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度40 % H印G2条件培养液、 ImM非必需氨基酸、5 y MP -巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10% FBS，溶剂为DMEM/ F12基础培养液；所述H印G2条件培养液按如下方法制备：将H印G2细胞以5X 104Cells/ cm2密度接种于培养皿中，按1.75X 105cells/mL培养液的量加入含体积终浓度10% FBS 的DMEM培养液，置于37°C、5% C02条件下培养4-5天后收集上层培养液，离心除去细胞碎 片，上层清液经0. 22 y m滤膜抽滤，滤液即为H印G2条件培养液；所述诱导液I终浓度组成 为：体积浓度 5%FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、50ng/mLFGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素钠，溶剂为DMEM/F12基础培养液； (2) 将生长至90 %汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度2 y g/ml丝裂霉素C的 DMEM培养液浸泡，在37°C，5% C02培养箱中培养3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7. 4的 PBS缓冲液洗涤，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞； (3) 用accutase消化步骤（1)获得的毛细胞前体细胞，静置沉淀，弃去沉淀，将细胞悬 液以1〇5个/cm2的密度接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上，加入诱导液II，在37°C， 5% C02培养箱中继续诱导3-4周，获得含内耳毛细胞的培养液，收集内耳毛细胞；所述诱导 液II终浓度组成：体积浓度 5%FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10iiM RA、5iiM DAPT，溶 剂为DMEM/F12基础培养液。
【文档编号】C12N5/071GK104403988SQ201410607061
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】项黎新, 潘若浪, 邵建忠, 王萍, 刘小园 申请人:浙江大学