一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法
【专利摘要】本发明涉及一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，包括：以miRNA-505-3P基因为特异性的转录本，分别将该逆转录茎环引物的茎部碱基对的数量和环部的碱基个数规律的设计对应的几个梯度，经过对miRNA-505-3P的逆转录和real time-PCR检测，最终筛选出一个对于miRNA-505-3P基因特异性逆转录时效率最佳的逆转录茎环引物。本发明避免了对成熟体检测的干扰，通过茎环引物在茎部和环部的梯度性的调整，可以分别明确的看出环部碱基的结构和茎部碱基的结构分别对逆转录茎环引物的逆转录效率的影响，因此更容易设计出合理高效的逆转录引物。
【专利说明】一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测miRNA领域，特别涉及一种逆转录miR-505的莖环引物的设计方 法。
【背景技术】
[0002] 目前检测miRNA的技术主要有Northern印迹杂交（Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，et al. MicroRNAs in plants[J] · Genes Dev，2002, 16 (13):1616"1626)、 微阵列（Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，et al. MicroRNAs in plants [J]· Genes Dev，2002, 16(13) :1616"1626)和RT-PCR技术，但最常用和最灵敏的miRNA检测技术为 qRT-PCR。qRT-PCR最终产物的荧光信号浓度不仅仅取决于miRNA的初始表达量高低，它 还受到逆转录以及PCR扩增效率的影响。2005年，Chen等将反转录定量PCR技术引入到 miRNA的检测当中，建立了名为茎环的反转录定量PCR技术（stem-loop RT-PCR).他首先 设计了一个通用的茎环结构的反转录引物，随后在该序列的3'端加上5?8个碱基，与目的 miRNA的3'端反向互补。当目标miRNA存在时，该引物与其杂交进行反转录产生cDNA，再 加入正反引物和Taqman探针，进行定量PCR，这种莖环结构大大提高了反转录的效率和特 异性（Chen C，Ridzon D A，Broomer A J，et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT~PCR[J]. Nucleic acids research,2005,33 (20):el79-el79 ；Pieter Mestdaghj Tom Feysj Nathalie Bernard,et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA[J]. Nucleic Acids Research，2008, 36 (21):el43)〇
[0003] miR-505 位于小鼠 X 染色体 X:57647578-57647667 处，ATPllC 基因的第一和 第二外显子之间的第一个内含子中。2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用 于其靶标ASF/SF2 (可变剪接因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡 的作用（Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al. (2010) MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor (LRF) and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2) affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem，285:39551-39563) ,Kami R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信 号通路（Kami Rj Hippo Yj Lowe SWjKrainer AR(2008) The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORCLProc Natl Acad Sci USA 105(40):15323-15327),但是 ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现 miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3,与mTOR通路上的AKT 属于同一基因家族（Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al., (2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells. Mol Cancer，10:13539551-39563)。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物 学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起 到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾 病相关（Mathieu Laplante and David M. Sabatini，mTOR signaling at a glance (2009) J Cell Sci 122, 3589-3594.)。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，通过运用以2005 年，Chen等设计的通用茎环引物作为基本骨架，以miRNA-505-3P基因为特异性的转录 本，分别将该逆转录茎环引物的茎部碱基对的数量和环部的碱基个数规律的设计对应的 几个梯度，经过对miRNA-505-3P的逆转录和real time-PCR检测，最终筛选出一个对于 miRNA-505-3P基因特异性逆转录时效率最佳的逆转录茎环引物。
[0005] 本发明的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，包括：
[0006] (1)设计3个梯度在固定茎部为14对碱基互补配对时的特异性逆转录 miRNA-505-3P基因的茎环引物；
[0007] (2)设计4个梯度在固定环部为21对碱基互补配对时的特异性逆转录 miRNA-505-3P基因的茎环引物；
[0008] (3)设计real time-PCR的扩增引物；其中，上游引物 5' -GCGAGCACCGTCAACACTTG-3'，下游引物 5' -TGCAGGGTCTGACTTATT-3';
[0009] (4)采用（1)和⑵中的茎环引物将mir-505-3P基因逆转录为CDNA ;
[0010] (5)固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，3个梯度的环部结构所逆转 录出的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测；
[0011] (6)固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基对，4个梯度的茎部结构所逆转 录出的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测；
[0012] (7)比对（5)、（6)结果，进行real time-PCR的二次检测，确定逆转效率最佳的茎 环引物。
[0013] 所述步骤（1)中的茎环引物分别为：
[0014] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0015] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0016] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
[0017] 所述步骤（2)中的茎环引物分别为：
[0018] 5' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3'
[0019] 5' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3'
[0020] 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 '
[0021] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
[0022] 所述步骤（4)中逆转录前进行茎环引物处理，具体上机程序为95°C 30s，80°C 30s， 70°C 30s, 60°C 30s, 50°C 30s, 40°C 30s, 30°C 30s, 20°C 30s〇
[0023] 所述步骤（4)中的逆转录具体方法为：将茎环引物特异性的结合在miRNA-505_3P 序列上，随后将mir-505-3P的特异性逆转录为⑶NA,最后将酶灭活，低温保存。
[0024] 所述茎环引物特异性的结合的上机程序为16°C 15min，所述mir-505-3P的特异性 逆转录的上机程序为为35°C 60min，80°C 15min。
[0025] 所述步骤（5)和（6)中的PCR反应条件为：95°C预变性2min，95°C变性15s，60°C 退火30s，70°C延伸30s，从第二步开始共反应40个循环。
[0026] 所述步骤（5)和（6)中的电泳检测使用2%的琼脂糖凝胶。
[0027] 本发明旨在针对哺乳动物的miRNA-505基因构建一个既高效又特异性的逆转录 茎环引物。针对miRNA-505基因，通过改变通用茎环引物来进行高效逆转录引物的摸索，将 通用茎环引物先保持茎部碱基对的数目不变，再梯度改变环部的碱基个数，经过后续检测 可以判断哪个组合的逆转录效率最好。然后以最好那组的环部结构不变，再梯度改变茎部 碱基对的数目，经过后续检测即可以判断出茎环引物的最佳茎部碱基的结构和环部结构的 组合。
[0028] 本发明的工艺过程，以2005年，Chen等设计的通用茎环引物作为基本骨架，以 miRNA-505-3P基因为特异性的转录本，首先保持茎环引物的茎部碱基的配对数不变，再对 其环部设计3个梯度的碱基个数，同时还要在3'端加上10个碱基，与目的miRNA-505-3P 的3'端反向互补，以确保逆转录时的特异性。通过这3条逆转录引物同时将小鼠总mRNA 中的miRNA-505-3P逆转录为CDNA ;同时还要设计出real time-PCR的引物，茎环法的上游 引物较特殊，是由5'端碱基（模板外）与3'特异序列（模板内））部分组成的，这源于茎 环法特殊的模板链延长方式。上游引物的3'端有12个碱基与成熟体miRNA-505-3P的5' 端同源，而引物的5'端则人为延伸8个碱基，以增加目的片段的长度；下游引物固定设计18 个碱基在茎环引物的环部结构处，与环部结构的碱基同源。经过对成熟体miRNA-505-3P的 逆转录以及real time-PCR的检测，以筛选出逆转录效率最高时所得到的茎环部碱基结构 组成的茎环引物。再保持该茎环引物环部结构不变，茎部分别设计4个梯度的碱基配对数， 经过对成熟体miRNA-505-3P的逆转录以及real time-PCR的检测，最终可以得到一个对于 miRNA-505-3P基因特异性逆转录时，效率最高时最佳茎部和环部碱基结构组合的逆转录茎 环引物。
[0029] 将设计好的针对miRNA-505-3P基因特异性逆转录的茎环引物，对小鼠下丘脑组 织所提取的RNA进行逆转录，并分别将CDNA稀释两个梯度，进行real time-PCR检测，以确 认其扩增效率是稳定和高效的，以证明设计的逆转录茎环引物高效性的可靠性。
[0030] 有益效果
[0031] (1)本发明对miRNA-505-3P成熟体的逆转录，成功的避开了对其前体的逆转录， 因为前体在自然状态下也存在发夹结构，因此无法与反转录引物结合，因此避免了对成熟 体检测的干扰；
[0032] (2)通过茎环引物在茎部和环部的梯度性的调整，可以分别明确的看出环部碱基 的结构和茎部碱基的结构分别对逆转录茎环引物的逆转录效率的影响，因此更容易设计出 合理高效的逆转录引物，为以后在针对其它miRNA设计逆转录引物时提供重要的参考信 肩、。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为作为骨架的通用逆转录茎环引物；
[0034] 图2为3条在固定茎部为14对碱基互补配对时的特异性逆转录miRNA-505-3P基 因的茎环引物；
[0035] 图3为4条在固定环部为21个碱基数时的特异性逆转录miRNA-505-3P基因的茎 环引物；
[0036] 图4为茎环引物逆转录以及扩增的示意图；
[0037] 图5为固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，3个梯度的环部结构所逆 转录出的CDNA的融解曲线；
[0038] 图6为固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，3个梯度的环部结构所逆 转录出的CDNA的PCR扩增产物的电泳图；
[0039] 图7为固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基对，4个梯度的茎部结构所逆 转录出的CDNA的融解曲线；
[0040] 图8为固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基对，4个梯度的茎部结构所逆 转录出的CDNA的PCR扩增产物的电泳图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0042] 实施例1
[0043] (1)选择一个茎环引物骨架。（图1)
[0044] (2)针对mir-505-3P基因，固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，设计 3个梯度的环部结构：（图2)
[0045] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0046] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0047] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3'。
[0048] (3)针对mir-505-3P基因，固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基，设计4 个梯度的茎部结构：（图3)
[0049] 5' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3'
[0050] 5' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3'
[0051] 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 '
[0052] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3'。
[0053] (4)设计real time-PCR的扩增引物
[0054] PCR 的上游引物为 20bp :5，-GCGAGCACCGTCAACACTTG-3，
[0055] PCR 的下游引物为 18bp :5，-TGCAGGGTCTGACTTATT-3，。
[0056] 设计的不同的茎环引物所对应的PCR产物大小：
[0057]
[0058]
【权利要求】
1. 一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，包括： (1) 设计3个梯度在固定茎部为14对碱基互补配对时的特异性逆转录miRNA-505-3P 基因的莖环引物； (2) 设计4个梯度在固定环部为21对碱基互补配对时的特异性逆转录miRNA-505-3P 基因的莖环引物； (3) 设计real time-PCR的扩增引物；其中，上游引物 5' -GCGAGCACCGTCAACACTTG-3'，下游引物 5' -TGCAGGGTCTGACTTATT-3'; (4) 采用（1)和（2)中的茎环引物将mir-505-3P基因逆转录为CDNA; (5) 固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，3个梯度的环部结构所逆转录出 的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测； (6) 固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基对，4个梯度的茎部结构所逆转录出 的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测； (7) 比对（5)、（6)结果，进行real time-PCR的二次检测，确定逆转效率最佳的茎环引 物。
2. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（1)中的茎环引物分别为： 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3， 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3， 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
3. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（2)中的茎环引物分别为： 5 ' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3， 5 ' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3 ' 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 ' 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
4. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（4)中逆转录前进行茎环引物处理，具体上机程序为95°C 30s，80°C 30s，70°C 30s，60 °C 30s, 50°C 30s, 40°C 30s, 30°C 30s, 20°C 30s〇
5. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（4)中的逆转录具体方法为：将茎环引物特异性的结合在miRNA-505-3P序列上，随 后将mir-505-3P的特异性逆转录为⑶NA，最后将酶灭活，低温保存。
6. 如权利要求5所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述莖环引物特异性的结合的上机程序为16°C 15min，所述mir-505-3P的特异性逆转录的上 机程序为为 35°C 60min，80°C 15min。
7. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（5)和（6)中的PCR反应条件为：95°C预变性2min，95°C变性15s，60°C退火30s， 70°C延伸30s，从第二步开始共反应40个循环。
8. 如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所 述步骤（5)和（6)中的电泳检测使用2%的琼脂糖凝胶。
【文档编号】C12Q1/68GK104372083SQ201410606864
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】熊黎, 肖君华, 周宇荀, 仝莉, 王茂春 申请人:东华大学