一种人血浆中miR-9荧光定量PCR的检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法。其特征在于首先设计特异性的“茎环状”逆转录引物以及特异性的miR-9PCR扩增引物，然后建立和优化实时定量反应体系和反应程序，最后根据△Ct法计算出miR-9的相对表达量。本发明由于利用了特异性的逆转录引物以及PCR引物，使得荧光定量PCR的特异性得到了保障，是一种高灵敏度、高特异性、快速而准确地检测miR-9的方法，为临床肿瘤的诊断、监测以及预后提供了一个实用的方法。
【专利说明】—种人血浆中miR-9荧光定量PCR的检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人血浆中miR-9荧光定量PCR的检测方法和试剂盒，可用于肿瘤病人血浆中miR-9的检测。属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是一种非编码的、内源性的小分子RNA，长度约20-23个核苷酸。miRNAs能够特异性地与靶基因mRNAs上3’非编码区(3’UTR)的互补序列结合，从而阻止蛋白的合成。每个miRNA可以有多个祀基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。miRNAs有着很强的保守性，不同种属以及组织器官之间相同的miRNAs具有相似的调节功能。另外，miRNAs又有着很强的特异性，不同的组织细胞中miRNAs的表达谱是不同的。miRNAs主要是通过转录后抑制基因的表达，从而在生物体内的各种生理过程中起着重要的调控作用。研究报道显示，miRNAs在体内参与多种细胞的发育、成熟、增殖、分化和凋亡。miRNA的表达、功能在不同的生理系统的发育中起着非常重要的作用。miRNA的异常表达会导致机体正常生理功能的紊乱，从而导致多种疾病的发生。大量研究表明，miRNA的表达和功能与人类多种疾病有着密切的联系，包括肿瘤、代谢性疾病、神经性疾病、感染、慢性炎症以及自身免疫病等。大量研究指出，miR-9的表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系。然而，在不同的肿瘤类型中，miR-9的表达量又是不尽相同的。因此miR-9的检测对于不同肿瘤的诊断以及预后有着重要的意义。
[0003]目前,检测miRNA主要有三种方法:第一,通过Northern印迹分析,是通过杂交检测RNA的常用方法，但由于其操作繁杂，耗时长，不能进行大量的筛选试验，且检测的动态范围只能达到两个数量级，特异性不高，因此就限制了临床珍惜标本的检测，亦不利于开展大量的实验研究。第二，通过微点阵分析，也是基于杂交原理来检测RNA的一种方法，采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描，相关软件分析对miRNA进行定量。此方法能对miRNA进行高通量的检测分析，但是标本需求量也较大，且不能区分序列差异很小的miRNA，亦造成假阳性。第三种方法是实时定量PCR，此方法先利用一种茎环状引物进行逆转录，再设计PCR特异性扩增引物，然后进行实时定量PCR。该方法特异性、灵敏度都很高，且样本需求量也少，为临床标本的检测以及科学研究提供了非常好的技术平台。
【发明内容】
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[0004]本发明采用实时 荧光定量PCR技术，通过设计特异性茎环状逆转录引物和特异性PCR扩增引物的方法，从而提高了检测的特异性，为临床提供了一种能够实时、准确、检测人血浆中miR-9表达的检测方法和试剂盒。
[0005]本发明所采用的技术方案如下:
[0006]一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR检测方法:首先设计特异性的茎环状逆转录引物和特异性PCR扩增引物，然后经过逆转录、实时荧光定量PCR程序，优化反应体系，采用Δ Ct法计算miR-9的相对表达量。
[0007]hsa-miR-9特异性逆转录引物,序列如下:
[0008]5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACA-3’ (SEQ IDN0.1)
[0009]hsa-miR-9荧光定量PCR引物，序列如下:
[0010]正向引物:5’-GGGTCTTTGGTTATCTAGC-3’(SEQ ID N0.2)
[0011]反向引物:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID N0.3)
[0012]本发明检测方法中，所述荧光定量PCR20 μ I反应体系由下列组分构成:10μ ISYBR 1^乂，1(^]?正向引物、反向引物各14 1，14 1样本cDNA，补充灭菌水至于20 μ I。
[0013]本发明检测方法中，所述PCR反应程序为95°C 10min，95° cl5sec，60°C 15sec，72°C 15sec，扩增40个循环。
[0014]一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测试剂盒:该试剂盒含有特异性miR_9逆转录引物(如SEQ ID N0.1所示)；特异性的miR-9PCR扩增引物(如SEQ ID N0.2和3所示)；逆转录试剂；PCR试剂。
[0015]进一步地，所述的逆转录试剂含有5X逆转录缓冲液，2.5mM的dNTP，200U/y IMMLV逆转录酶，40U/ μ I RNA酶抑制剂和无核酸酶的水。
[0016]进一步地，所述的PCR试剂为SYBR Mix。
`[0017]本发明利用荧光定量PCR技术提供了一种能够实时、快速、准确地检测人血浆中miR-9的检测方法，从而填补了该miRNA在检测方法方面的空白。
[0018]本发明由于利用了特异性的逆转录引物以及PCR引物，使得荧光定量PCR的特异性得到了保障，是一种高灵敏度、高特异性、快速而准确地检测miR-9的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为荧光定量PCR样本扩增的融解曲线
[0020]图中横坐标代表解链温度[0021 ]图中纵坐标代表相对荧光强度。
[0022]图2为荧光定量PCR样本扩增的荧光信号图
[0023]图中横坐标代表循环数
[0024]图中纵坐标代表相对荧光强度
[0025]图中平行于横坐标的直线代表循环阈值。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，但应当理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0027]材料:
[0028]血衆miRNA 提取试剂盒(Macherey-Nagel), NanoDroplOOO (Thermo),MMLV 逆转录酶(Takara), 5X 逆转录缓冲液(Takara), 2.5mM dNTP (Takara), RNA 酶抑制剂(Takara),SYBR Green Real Time PCR Kit (Thermo), DEPC 水，普通 PCR 仪(ABI)，CFX-96 荧光定量PCR 仪(Biorad)。[0029]实施例:
[0030]肺癌患者血浆中miR-9的检测
[0031]1、引物的设计与合成
[0032]先从http://www.mirbase.0rg/ 中查找 hsa-miR-9 的成熟序列(MIMAT0000441),然后设计三条引物序列，送上海生物工程有限公司合成。
[0033]hsa-miR-9的成熟序列如下:
[0034]UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA (SEQ ID N0.4)
[0035]hsa-miR-9特异性逆转录引物，序列如下:
[0036]5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACA-3’ (SEQ IDN0.1)
[0037]hsa-miR-9荧光定量PCR引物，序列如下:
[0038]正向引物:5，-GGGTCTTTGGTTATCTAGC-3，(SEQID N0.2)
[0039]反向引物:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID N0.3)
[0040]2、血浆miRNA的抽提
[0041]取300 μ I肺癌患者血浆于1.5ml离心管中，按照血浆miRNA提取试剂盒中所述的步骤提取血浆中的miRNA(见厂家使用说明书)，通过NanoDrop1000测量RNA的浓度与纯度，质量良好的标本进行下一步实验。
[0042]3、hsa-miR-9特异性逆转录
[0043]使用由上海生工生物有限公司合成的miR-9特异性的逆转录引物，以及Takara公司提供的MMLV逆转录酶、5 X逆转录缓冲液，2.5mM dNTP, RNA酶抑制剂进行逆转录，10 μ1
逆转录体系如下:
[0044]
【权利要求】
1.一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于首先设计特异性的“茎环状”逆转录引物以及特异性的miR-9 PCR扩增引物，然后经逆转录、荧光定量PCR程序，最后根据Λ Ct法计算出miR-9的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，其中特异性的miR-9逆转录引物的序列如SEQ ID N0.1所示；特异性的miR-9 PCR扩增引物序列如SEQ ID N0.2和3所示。
3.根据权利要求1所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，其10 μ I逆转录体系如下:5Χ逆转录缓冲液2μ1，62.5ηΜ的特异性逆转录引物I μ I，2.5mM 的 dNTP 0.5 μ I，200U/ μ I 的 MMLV 逆转录酶 0.5 μ I，40U/ μ I 的 RNA 酶抑制剂.0.2 μ I, lug 样本 RNA,补充 DEPC 水至 10 μ L.
4.根据权利要求1所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，逆转录程序如下:先将RNA与DEPC水混合，于PCR仪上预变性，70 oC IOmin,冰上静置.2min ;再将其他试剂加入，于PCR仪上42 oC 60min, 70 oC IOmin0
5.根据权利要求1所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR中，20 μ I PCR反应体系由下列组分构成:10 μ I SYBR Mix，10 μ M正向引物、反向引物各I μ 1，I μ I样本cDNA,补充灭菌水至于20 μ I。
6.根据权利要求5所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，其 PCR 反应程序如下:95°C 10min,95°c 15sec,60°C 15sec , 72°C 15 sec，扩增 40 个循环。
7.—种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有特异性miR-9逆转录引物，如SEQ ID N0.1所示；特异性的miR-9 PCR扩增引物，如SEQ ID N0.2和3所示；逆转录试剂；PCR试剂。
8.根据权利要求7所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，所述的逆转录试剂含有5 X逆转录缓冲液，2.5mM的dNTP，200U/y I MMLV逆转录酶，.40U/ μ I RNA酶抑制剂以及无核酸酶的水。
9.根据权利要求7所述的一种人血浆中miR-9的荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR试剂为SYBR Mix。
【文档编号】C12Q1/68GK103882129SQ201410101603
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】田洁, 王胜军, 马斌, 芮棵, 马洁, 汤新逸, 田新宇, 沈培, 许化溪 申请人:江苏大学