一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生理学及细胞分子生物学领域，具体涉及一种单细胞实时荧光定量 PCR检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 基因表达水平的实时定量检测是医学及生命科学研宄中的重要内容，是研宄疾病 的发病机理及临床诊断、治疗的重要技术手段，如在病理状态下检测疾病易感基因或关联 基因的表达变化或外加因素处理前后相关基因的表达差异等。目前常规的方法是采集组 织块或组织液标本，提取RNA并反转录为cDNA，再进行实时定量检测，根据目前最常用的 壮匕〇1法提取8隱的要求，组织块质量要求约50-10011^，细胞数量要求约5\10 6个细胞。 现有方法不适用于微量及痕量组织标本基因表达的定量检测。
[0003] 组织块或组织液成分复杂，含有多种细胞及细胞外基质。某一特定组织的某一种 细胞甚至某一个细胞中基因表达的定量检测是现代医学和生命科学研宄中至关重要技术 手段。然而，现有方法只能针对组织块或组织液整体进行RNA提取、反转录及基因定量检 测，不适用于组织中某一种特定细胞甚至某一个特定细胞的基因定量检测。因而，需要一种 更为精确、灵敏、尚效的基因定量检测技术。
[0004] 单细胞实时荧光定量PCR技术是以单个细胞为模板，将mRNA反转录为CDNA，再进 行相关基因的定量检测。该技术通常包含以下步骤：（1)捕获单细胞，（2)单细胞裂解及基 因组DNA消化，（3)反转录合成cDNA，⑷cDNA扩增复制，（5)实时荧光定量PCR检测。该 方法精确度高，灵敏度高，能够准确的对单个细胞的基因表达水平进行检测，并且可同时检 测同一个细胞内的多个基因。该方法解决了常规方法中组织块成分复杂，不能精确检测单 个细胞的缺陷，解决了常规方法中不能检测微量及痕量标本的缺陷。
[0005] 现有的常规单细胞实时荧光定量PCR技术中主要存在以下问题：
[0006] (1)捕获单细胞通常使用的是细胞膜片钳技术，首先将膜片钳玻璃微管电极接触 细胞，同时施加一定的负压，将细胞吸入玻璃微管电极中。然而，膜片钳玻璃微管电极口径 约为1-5 μ m，远远小于细胞直径，用这样的电极接触细胞后施加负压，不能将完整的细胞吸 入电极，只能将一小部分细胞膜吸破，导致细胞从电极尖端脱落，细胞核及细胞质丢失，无 法捕获完整的单个细胞。如果采用电极口径大于细胞直径的玻璃微管电极捕获单细胞，负 压抽吸将在吸入细胞的同时吸入大量的细胞浴液，使细胞浴液充满整个玻璃微管电极，并 倒灌进入电极夹持器内部，污染电极夹持器。电极夹持器被污染后将导致膜片钳实验噪声 增大，严重影响实验结果的准确性，严重影响膜片钳系统的精准性。
[0007] 过多的细胞浴液还会降低反转录的效率。一般情况下，反转录时反应液体积最多 不超过25uL，如果电极中吸入了过多的溶液，在配制反转录反应液时体积容易超过25uL， 会改变反应液中酶及各种离子的浓度，将影响反转录的效率及成功率。捕获单细胞时，如果 在吸入细胞的同时吸入了过量的细胞浴液，常规的解决方法是在反转录前，通过离心使细 胞沉降，然后除去多余的溶液。但通过离心使单个细胞沉降的成功率很低，并且离心易导致 细胞受损破裂，RNA丢失，无法获得完整的单个细胞，而降低实验的准确度和灵敏度。
[0008] (2)单个细胞mRNA量约lpg，反转录获得的cDNA量极少，对于一些表达丰度低的 基因检测难度大，同时，不能满足同时检测多个基因的要求。因此，需要对cDNA进行扩增复 制。
[0009] 常规的cDNA复制扩增只针对目的片段，在目的片段的上游和下游分别设计引物， 用PCR方法将含有目的片段的部分cDNA序列进行扩增复制，再以扩增产物为模板，用目的 基因的引物进行PCR检测。因此，在检测多个基因时，常规方法需要针对多个不同待检基因 分别设计cDNA扩增复制引物，由于不同引物的扩增效率不同，必然将导致该方法在进行多 个基因检测时，扩增效率参差不齐，并且操作繁琐。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种单细胞实时荧光 定量PCR检测方法。该检测方法采用膜片钳技术中的玻璃微管电极，在倒置相差显微镜下， 根据毛细现象原理捕获单个细胞，然后采用Oligo (dT) 2(|引物，以mRNA为模板反转录合成 cDNA，对表达丰度极低的基因可采用多次退火环状循环扩增技术进行cDNA扩增复制，最后 再进行实时荧光定量PCR检测。本发明所述检测方法误差小、准确度和灵敏度高，适用于急 性酶分离的哺乳动物细胞、原代培养的细胞、传代培养的成熟细胞系等多种细胞。
[0011] 本发明的再一目的是提供一种单细胞实时荧光定量PCR试剂盒。
[0012] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0013] 本发明所述的单细胞实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
[0014] (1)单细胞捕获
[0015] A、细胞准备
[0016] 将细胞悬液滴于浴槽中让其自然贴附，静置8~15min后，加入台式液备用；
[0017] B、电极准备
[0018] 拉制电极的毛细玻璃管先经150~200°C干烤4~8h后再用于拉制电极；将制备 电极的毛细玻璃管固定于垂直微管电极拉制仪上；电极经两步拉制，第一步中电流为55~ 65mA，粗拉使毛细玻璃管中间拉成一窄细状，第二步中电流为50~60mA，拉制使窄细部位 断开；
[0019] C、细胞收集
[0020] 借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极进入浴槽溶液并靠近细胞，利 用微推进器接触浴槽底部将电极尖端折断，再利用微推进器将折断尖端的电极顺着细胞 的纵长方向靠近细胞，让细胞顺势滑入电极；迅速将电极提出液面，深入到收集细胞的无 RNase的PCR管底部，将电极内的细胞连带液体全部推入管内，最后在PCR管侧壁折断电极 前端，迅速冷冻；
[0021] (2) cDNA 的合成
[0022] A、细胞裂解
[0023] 采用冻融法裂解细胞，得到裂解的细胞液；
[0024] B、基因组DNA消化
[0025] 将裂解的细胞液配制成IOyl的细胞基因组DNA酶解体系，置于37 °C下反应 30min，然后加入0. 5mol/l的EDTA ΙμL，终止反应，其中EDTA的pH为8. O ;接着于65°C下 孵育lOmin，再在3~5°C下离心25~40s，备用；
[0026] C、反转录合成cDNA
[0027] 在上述步骤（2)B项得到的体系中加入lOpmol/μΙ的01igo(dT)2(lly 1，65°C孵 育5min，冰浴1~3min，得变性后的RNA溶液；将变性后的RNA溶液12 μ 1、5 X RT Buffer 4 μ l、dNTP Mixture 2 μ l、Rever Tra Ace 反转录酶 1 μ 1 和 DEPC 处理的去离子水 1 μ 1 混 合，配制成反转录反应液；反转录的反应条件为42°C反转录合成20min，99°C变性5min，4°C 保存5min，得到cDNA ;
[0028] D、cDNA 扩增
[0029] cDNA扩增采用单细胞全基因组扩增试剂盒；
[0030] 取 1 μ L cDNA，加入 5 μ L Cell Lysis Buffer、。· 1 μ L Cell Lysis Enzyme，混 匀，得到体系I，将体系I于PCR仪中50°C孵育50min，80°C孵育IOmin ;然后加入30yL Pre-Amp Buffer、l μ L Pre-Amp Enzyme Mix，混勾，得到体系 II，将体系 II 于PCR仪中 94°C 孵育311^11;20°0孵育4〇8,30°0孵育4〇8,40°0孵育3〇8,50°0孵育3〇8,60°0孵育3〇8,70°〇孵 育 4min，95°C孵育 20s，58°C孵育 10s，共 8 个循环；再加入 30 μ L Amplification Buffer、 0· 8 yL Amp Enzyme Mix，混匀，得到体系III，将体系III于PCR仪中94。。孵育30s ;94°C 孵育20s，58°C孵育30s，72°C孵育3min，共18个循环，产物纯化后于-20°C保存，得到cDNA 模板；
[0031] (3)用SYBR Green染料法对基因表达水平定量检测
[0032] 将 SYBR Green PCR master mix 10 μ 1、10 μmol/1 的上游引物 0· 5 μ 1、10 μmol/ 1的下游引物〇. 5 μ 1、cDNA模板2 μ 1、无菌水7 μ 1混合均勾，得到Real time PCR反应体 系；
[0033] PCR反应程序如下：
[0034] ① 95°C 预变性 3min ;
[0035] ② 94°C变性 30sec ;
[0036] ③ 59°C退火 30sec ;
[0037] ④ 72°C延伸 30sec ;
[0038] ⑤ 78 °C 温浴 lsec;
[0039] 读板，步骤②至⑤重复44个循环；
[0040] 72°C延伸 IOmin ;
[0041] 生成熔解曲线，从65°C至98°C，每1°C持续Isec ;
[0042] 72°C延伸 IOmin。
[0043] 本发明所述检测方法采用膜片钳技术捕获单个细胞，在倒置相差显微镜下，首先 将玻璃微管电极接近细胞，但不与细胞接触，当电极尖端接近细胞后，操作微推进器在浴槽 底部将电极尖端折断，根据毛细现象原理，