淋病奈瑟菌实时荧光pcr快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于淋病奈瑟菌实时荧光PCR快速 检测试剂盒，可用于淋球菌感染的早期检测，对淋病进行临床辅助诊断。
【背景技术】
[0002] 淋病奈瑟菌（NG)简称淋球菌，是淋病的病原菌，其惟 一的宿主就是人类。淋病是危害较大的传染性疾病之一，以血液传播、性传播、一般的体液 传播及私人用品传播为传播途径，是一种古老而又常见的性病。淋病以泌尿生殖系统化脓 性感染为主要表现，主要发生在尿道和子宫颈粘膜，也可累及眼、咽、直肠和盆腔，可损害生 殖系统及全身其他器官，严重者可导致不孕不育。而且淋病感染后的潜伏期（14天以内)症 状不明显，一旦过了潜伏期，就具有了明显症状，若不及时诊治，会导致严重的泌尿生殖疾 病等，所以应及早对淋病进行诊断及治疗。
[0003] 近年来淋病的发病率呈直线上升趋势，发病率居中国性传播疾病首位，而且多发 于青壮年。此外，淋球菌感染可增加艾滋病感染的风险达5倍以上。因此，淋病不仅严重危 害患者的身心健康，而且影响了社会的稳定及精神文明建设，所以做好淋病的防治工作具 有重大的意义。而淋病的防治的关键在于NG感染的早期诊断，只有对可疑患者进行及时的 诊断，才能有效的治疗和预防淋病。
[0004] 临床上对于淋病的确诊主要依靠 NG的检测结果，而临床检测方法一般常用是直 接涂片染色法、分离培养法、快速检测法及抗原检测等等，但是这几种方法在敏感性和特异 性上都有不足，容易漏检。近年发展起来的PCR方法则具有灵敏度高，特异性强，且简便省 时等特点，逐渐应用于临床样本的辅助诊断，尤其是在原普通PCR的基础上，发展起来的实 时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的 全过程可以再单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结 果，避免了 PCR后的处理，是一种先进的分子定量检测技术。
[0005] 目前市场已出现了多家以荧光PCR为基础的NG诊断试剂盒，例如中山大学达安基 因股份有限公司，凯杰生物工程（深圳）有限公司，上海之江生物科技有限公司等。但是大 多以荧光探针法为主，由于要进行荧光物质和淬灭物质双重标记，使得探针合成成本比较 高，影响其市场推广以及病人承受能力。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种灵敏、准确、检测成本低的淋病奈瑟菌实时荧光PCR快速 检测试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种淋病奈瑟菌实时荧光PCR快 速检测试剂盒，包含PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品、裂解液及蛋白酶 K溶液；PCR反应液中包含了针对淋病奈瑟氏菌特异序列设计的正向引物、反向引物和SYBR Green I 染料； 正向引物序列为：5'_ ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物序列为：5'_ GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 裂解液包含 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、0· 2mM EDTA(pH8. 0)、 l%(V/V)TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20 ； 阳性质控品与弱阳性质控品是含插入淋病奈瑟氏菌特异性保守序列的PCR2. I载体质 粒，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5 α中增殖后经提取纯化、用分光光度计测定浓度和纯 度后用无菌TE缓冲液定量稀释；阴性质控品是灭菌去离子水。
[0008] PCR反应液还包含热启动Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种核苷酸。
[0009] 上述正向引物、反向引物的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括 引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'方向延伸一至数个碱基或删减一至数个 喊基得到的序列。
[0010] 本试剂盒保存于-20°c以下，尽量减少反复冻融。本发明即淋病奈瑟菌实时荧光 PCR快速检测试剂盒，用于临床样本中淋病奈瑟氏菌的快速检测，用于淋球菌感染的早期检 测，用于淋病奈瑟氏菌感染的辅助诊断。
[0011] 本发明针对淋病奈瑟氏菌特异性基因保守序列设计特异性PCR引物，能特异性扩 增靶DNA序列，从而达到临床诊断目的，可以简便快速的检测临床样本中淋病奈瑟氏菌感 染，具有特异性好、灵敏度高的特点。本发明与其它检测技术相比主要具备以下优点： 1、 相对于常规PCR技术，本产品具有操作简便，结果明了等特点产物不要凝胶电泳检 测，完全闭管操作，有效的减低了 PCR产物污染的风险； 2、 对于探针法荧光PCR技术，本产品采用SYBR Green染料法，价格低廉，有效 地降低了生产成本； 3、 检测速度快，整个实验操作仅需2-3个小时，操作简单； 4、 用于淋球菌感染的早期检测，尽早诊断治疗。
[0012] 总之，本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单、快速明了、价格低廉等 优点；同时闭管操作，减少后续反应产物带来的污染的可能性，是一种适用于临床样本中淋 病奈瑟氏菌的快速检测的试剂盒。
【附图说明】
[0013] 图1是淋病奈瑟氏菌检测试剂盒的灵敏度实验数据图，图中横坐标cycle表 示扩增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S1-S6分别表示浓度为5. OXlO4c0Pies/ μ 1>5. OX IO3Copies/ μ 1>5. OX IO2Copies/ μ 1>5. OX IOcopies/ μ 1>5. Ocopies/ μ 1> 5. OX 10 kopies/y 1的阳性指控品的扩增曲线，各3个重复数据，CK为阴性质控品； 图2是淋病奈瑟氏菌检测试剂盒的特异性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循 环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表NG阳性质控品扩增曲线，B代表特异性参考品扩增 曲线和阴性指控品扩增曲线，特异性参考品分别为大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克 雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌与沙眼衣原体； 图3是淋病奈瑟氏菌检测试剂盒的阴性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循环 数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表NG阳性质控品扩增曲线，B代表20个无菌去离子重 复样本的扩增曲线； 图4是淋病奈瑟氏菌检测试剂盒的精密度实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循 环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，SO为10份浓度为5. OX IO5Copies/μ 1的阳性参考品扩 增曲线，S4为10份浓度为5.0X10C〇pies/l·! 1的阳性参考品扩增曲线，CK代表阴性质控 品； 图5是淋病奈瑟氏菌检测试剂盒的检测限实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循 环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S5为20份浓度为5. Ocopies/ μ 1的NG阳性参考品扩增 曲线，CK表示阴性质控品。
【具体实施方式】
[0014] 本试剂盒采用SYBR Green染料法荧光PCR检测技术，快速检测临床样品中淋球菌 特有序列，从而判断淋球菌的存在。对保守序列我们共设计多对引物，并对其进行实验验 证，最后选择了灵敏度高、特异性好的一对引物。下面实施例中未说明的常规方法和条件可 参考《分子克隆实验指南》第三版或按照试剂制造商说明书中所建议的步骤和条件。
[0015] 实施例1试剂盒的制备 1、 试剂盒特异性引物的设计与合成 根据网上公布的NG序列（GenBank :AJ223446. 1)，针对淋球菌保守基因 PorA片段利用 生物学软件Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件对淋球菌PCR引物进行设计，并且用 软件Mega4和NCBI在线Blast进行序列比对，保证每对引物特异性和合理性。引物委托宝 生物工程(大连）有限公司合成，采用PAGE纯化，试剂盒特异性引物核苷酸序列如下： 正向引物：5'- ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物：5'- GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 2、 NG质粒阳性质控品的设计与制备 在上述NG特异性引物扩增序列的外围序列，重新设计一对扩增引物，该引物扩增片段 能完全覆盖住设计的NG特异性引物扩增区域。该外围引物委托宝生物工程(大连）有限公 司合成，采用PAGE纯化，该外围引物核苷酸序列如下： 正向引物：5' -AACTTACCGCCCTCGTATTGTC-3'， 反向引物：5' -CCACATTATTATTGCTGTCCCA-3'， 采用该引物扩增的特异性核苷酸序列为： 5'-AACTTACCGCCCTCGTATTGTCCGCACTGCCGTTTGCGGCAGTTGCCGATGTCGGCCTGTACGGCGAAG TCAAAGCTGGTGTGGAAGGCAGGAACATCCGGCTGCAGTTGACCGAGCCACCCTCAGACTGTCAAACGGGCAATACA GTTACTAAGGCCAAAAGCCGCATCAGGACGAAAGTCAGTGATTTCGGCTCGTTTATCGGCTTTAAGTTGGTGGGGAT TTGGGCGGCGGGCTGAAGGCTGTTTGGCAGCTCGAGCAAGACGTATCCGTTGCCGGCGGCGGCGCGACCCGTTGGGG TAACAGGGAATCCTTTATCGGCTTGGCAGGCGAATTCGGCACGGCGCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCG ATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGG-3' 422bp 〇
[0016] 利用上述外围引物和NG临床阳性样本DNA裂解液进行PCR扩增，将得到的PCR产 物纯化后连接到质粒PCR2. 1载体上，然后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，通过蓝白 斑初筛后，再经过PCR鉴定为阳性的菌落，通过扩大培养后，提取阳性重组质粒，经双向DNA 测序鉴定后，作为阳性质控品的制备原料。
[0017] 质粒pCR2. 1载体通过商业途径获得，购自于Invitrogen公司；大肠杆菌DH5 α感 受态细胞通过商业途径获得，购自于TAKARA公司。
[0018] 3、质控品的制备 阳性质控品由阳性质控品的制备原料、采用TE缓冲液稀释制备；阳性质控品采用浓度 为1.0 X IO6C