乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光pcr试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检验技术领域，具体设及一种乙型肝炎病毒八种基因分型的巧光 PCR试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 乙型病毒性肝炎是长期困扰全球医学界的难题，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重 要致病因子之一，也是全世界最严重的公共卫生问题之一。据WT0报告，全球60多亿人 口中，有大约30亿人口生活在乙型肝炎病毒（皿V)高流行地区，超过20亿人感染过皿V，其 中慢性感染者超过3.5亿。我国每年的乙肝发病率在6 000万人次W上，是一个乙型病 毒性肝炎发病大国。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50%的肝硬化和70 - 90% 的肝癌，是由慢性皿V感染引起，而感染了皿V变异体的皿V携带者有7 - 30%。
[000引 目前根据基因序列的核巧酸差异将皿V分为A~Η8种基因型别，按照全基因序 列核巧酸差异> 8%或其S基因序列核巧酸差异> 4%的差异度判定为不同型别，同一基因 型满足序列差异《5. 6%。皿V基因型别存在较明显的地域性分布特点，A型在欧洲和中部非 洲多见巧型、C型主要分布于亚洲；D型分布区域最广，流行于地中海、中东等地区；E型W 非洲为主；G型仅见于美国和欧洲；F、Η型分布在美国。我国WB型和C型分布为主，为优 势型，且存在南北差异，北方WC型为优势型，南方WΒ型为优势型；D型多分布于如新疆、 西藏、宁夏等少数民族地区，偶有A、E、F型报道，尚未见G、H型。有研究表明，皿V存在不同 基因型别的混合感染。
[0004] 目前乙型肝炎病毒基因分型的检测方法包括基因序列测定、聚合酶链反应-限制 性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)、基因型特异性多引物对PCR分型（即巢式PCR法）、特 异性线性探针检测法（INNO-LiPA)INN〇-LiPA、PCR微板核酸分子杂交化ISA法、单克隆抗体 ELISA法W及基因忍片。但运些方法或多或少存在一些缺陷：如基因测序分型方法结果准 确可靠，但过程繁琐、费时、成本高、难W推广，不适合大样本的检测，且缺乏敏感性，不能发 现同一个体中两种或两种W上的皿V基因型的混合感染。PCR-RFLP对于单个核巧酸位点的 多态性所导致的限制性内切酶酶切位点改变有碍内切酶消化，酶切不完全会出现复杂的条 带，酶切图谱识别复杂，因而影响基因分型的可信度，且该法同样不能发现几种基因型的混 合感染。巢式PCR法方法需要合成多条引物，需经两轮PCR过程，较RFLP法历时长，污染机 会较大，且无法完全避免出现非特异性扩增条带而妨碍观察分型结果。INNO-LiPA存在价格 昂贵、特异性稍低的不足。单克隆抗体ELISA法不能对血清皿sAg阴性的皿V感染进行基 因分型，W及少数皿sAg无法分型。基因忍片存在成本较高、假阳性率高、不同忍片的集成 度不足等缺点，PCR微板核酸分子杂交化ISA法适用于自动化程度高较高的实验室。
[0005] 对于分子实验室中大量样本的常规检测，急需准确度高、特异性好、价格经济、快 速的检测方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种乙型肝炎病毒八种基因分型的巧光PCR试 剂盒及检测方法，通过设计合成特异性针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的引物和探针，并 结合PCR检测方法的技术方案，实现了快速、准确测定乙型肝炎病毒分型，测定成本降低。
[0007] 本发明采用的技术方案是：乙型肝炎病毒八种基因分型的巧光PCR试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒中包括如下三.、至⑨中的至少一个PCR反应液体系： ① 针对乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA 皿V-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG ② 针对乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT 皿V-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT皿V-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC ③ 针对乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT HBV-C-PCCCCAACAAGGATC ④ 针对乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT 皿V-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC ⑥ 针对乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT ⑧ 针对乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC 皿V-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT 皿V-F-PATGGATACCCACAGATAA ⑦ 针对乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG 皿V-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT ⑨ 针对乙型肝炎病毒Η型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA 皿V-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA皿V-H-PATCTACAACCACCAGCACG。
[0008] 优选的，所述每种探针一端标记有巧光报告基团FAM、ΤΕΤ、肥X、R0X、JOE、CY3、 CY5、TAMRA或TexasRed,另一端标记有巧光泽灭基团MGB、B册-1、B册-2、LowaBlackRQ、 LowaBlack?FQ或D油巧 1。
[0009] 更优选的，所述针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应 体系，其中皿V-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，皿V-B-P的5'端标记肥X，3'端标记 MGB，皿V-C-P的5'端标记R0X，3'端标记MGB，皿V-D-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB; 针对乙型肝炎病毒E-H型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系，其中皿V-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，皿V-F-P的5'端标记肥X，3'端标记MGB，皿V-G-P的5' 端标记R0X，3'端标记MGB，皿V-H-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB。
[0010] 所述试剂盒中还包括乙型肝炎病毒A-H型基因型的标准品。
[0011] 本发明还提供乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在于，所 述方法包括W下步骤： (1) 合成权利要求1所述的引物和探针； (2) 根据仪器对各探针两端分别标记权利要求2中所述的巧光报告基团和相应的巧光 泽灭基团； (3)制备阳性标准品； (4) 提取待测样品DNA; (5) 准备PCR反应体系； (6) 运行PCR; (7) 数据分析。
[0012] 优选的，所述步骤（3)中阳性标准品的制备方法为构建分别包含乙型肝炎病 毒A-H八种基因亚型检测祀标基因标准序列的质粒：分别合成乙型肝炎病毒A-H八种基 因亚型检测祀标基因标准序列并克隆入P18-T载体中，命名为PMT-HBV-A，PMT-HBV-B， PMT-HBV-C，PMT-HBV-D，PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-H。
[0013] 更优选的，所述步骤（2)中探针的标记分别为：皿V-A-P的5'端标记FAM，3'端标 记MGB，皿V-B-P的5'端标记肥X，3'端标记MGB，皿V-C-P的5'端标记R0X，3'端标记MGB， 皿V-D-P的5'端标记CY5,3'端标记MGB;皿V-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，皿V-F-P 的5'端标记肥X，3'端标记MGB，皿V-G-P的5'端标记R0X，3'端标记MGB，皿V-H-P的5' 端标记CY5, 3'端标记MGB; 步骤（5)中PCR反应体系分成两个，针对乙型肝炎病毒ABCD型基因型的引物和探针加 入至第一反应体系，针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针加入至第二反应体系。
[0014] 优选的，所述步骤（6)运行PCR时巧光通道检测选择：检测选用FAM、肥X、R0X和 CY5通道。
[0015] 所述步骤（6)运行PCR是的反应程序为95°C2min;再按95°C15s，60°CImin，循 环40次。
[0016] 上述技术方案中，分别针对乙型肝炎病毒八种基因分型的引物和探针具有良好的 特异性，用于巧光PCR反应，不存在互相干扰，每种探针一端标记有巧光报告基团，另一端 标记有巧光泽灭基团，不同种探针的巧光报告基团不同，当被检测的样本在某种分型的引 物引导下扩增后，与相应分型的探针结合，通过其探针的巧光报告基团，则可检测出样本是 被哪种分型的乙型肝炎病毒感染，实际应用中，鉴于仪器、巧光素选择范围等因素，可将针 对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，针对乙型肝炎病毒E-H 型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系。
[0017] 为提高检测的准确性，试剂盒种配置了八种亚型的阳性标准品，该标准品可W是 各种亚型的全序列，（其序列全长可在基因库查)，也可W是包括检测祀标基因位点的一段 基因序列，上述序列委托公司合成即可，所述的检测祀标基因位点即本发明筛选的各亚型 的高度保守序列位点，应用时，通过PC