专利名称：半巢式pcr酶切分型快速检测军团菌试剂液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及军团菌分型检测技术领域，具体为一种不仅能检测临床和环境水标本中军团菌，而且可以将军团菌进一步分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速检测试剂液。
背景技术：
目前，军团菌检测试剂液主要分为两大类一是利用抗原抗体反应检测军团菌特异性抗体或抗原，此类试剂液包括军团菌ELISA法试剂液以及嗜肺军团菌尿抗原检测试剂液。因为军团菌相关抗原或抗体在军团菌感染病人体内出现较晚，一般需要一周及以上的时间才能检测到，只能检测嗜肺军团菌，而且具有一定的交叉反应，所以该类型的试剂液具有一定的局限性；第二类是利用分子生物学方法检测军团菌，如荧光定量PCR检测嗜肺军团菌试剂液，该试剂液仅可用以检测嗜肺军团菌，对非嗜肺军团菌不能检测。虽然临床上 80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起的，水环境也广泛存在嗜肺军团菌，但是非嗜肺军团菌也具有较为广泛的存在性和一定的感染力，目前已知至少有M种军团菌与人类疾病相关。因此，一种既能检测军团菌又能鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的检测试剂液是很必要的。
发明内容
本发明针对以上所述军团菌检测试剂液存在的不足，提供一种不仅能检测临床和环境水标本中军团菌，而且可以将军团菌进一步分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速检测试剂液。本发明是这样实现的一种半巢式PCR酶切分型快速检测军团菌的试剂液，包括细菌基因组DNA提取液、第一 PCR反应体系混合液、第二 PCR反应体系混合液、酶切反应液， 以上液体分别置于容器中，进行半巢式PCR和核酸内切酶酶切分析，用以鉴别嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。DNA提取液组成成分
DNA提取液组成浓度Chelex-IO 离子交换树脂(Chelex-IOOresin)5%三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl pH8. 3)10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Nei2)0.lmmol/L叠氮钠(NaN3)0. 1%
权利要求
1.一种半巢式PCR酶切分型快速检测军团菌试剂液，其特征在于，它由细菌基因组DNA 提取液、第一 PCR反应体系混合液、第二 PCR反应体系混合液和酶切反应液组成，以上各种液体单独盛于容器中；其中，第一 PCR反应体系混合液的组分为2XPCR反应混合液12.5μ 1，军团菌386上游引物0.9 μ 1，军团菌386下游引物0.9μ 1，双蒸水5. 7μ 1 ；第二 PCR反应体系混合液组分为2XPCR反应混合液12. 5 μ 1，军团菌2 上游引物 0. 9μ 1，军团菌2 下游引物0. 9μ 1，双蒸水5. 7μ 1。
2.如权利要求1所述的试剂液的应用，其特征在于检测军团菌的步骤如下 应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA ；以细菌基因组DNA为模板，应用第一 PCR反应体系混合液扩增15 35个循环后，以第一 PCR反应产物为模板，用第二 PCR反应体系混合液扩增35个循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将PCR产物加入到酶切反应液中，于65°C消化5min后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种军团菌快速检测试剂液，由细菌基因组DNA提取液、第一和第二PCR反应体系混合液、酶切反应液，以上各种液体分别置于容器中。还公开了试剂液的检测步骤，应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA，以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应体系混合液扩增15～35个循环后，以第一PCR反应产物为模板，用第二PCR反应体系混合液扩增35个循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将PCR产物加入到酶切反应液中，于65℃消化5min后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。试剂液被广泛运用于临床标本如痰液、支气管灌洗液和环境水标本中军团菌的检测，具有快速，简便，易于使用的优点。
文档编号C12Q1/68GK102251028SQ201110153420
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者刘洋敏, 朱庆义, 胡朝晖, 赵利伟, 陈文聪 申请人:郑州金域临床检验中心(普通合伙)