中国人群肥胖易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域中SNP分型检测领域，具体涉及一种中国人群肥胖 易感基因SNP分型试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 肥胖是一种常见的营养代谢性疾病。2002年WHO将肥胖列为造成人类疾病负担 的全球一级风险因素之一，预防肥胖症的流行也是21世纪前50年世界各国面临的最大公 共卫生挑战之一。家系分析和双生子研究表明遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作 用，有研究显示父母双方有一方肥胖者，其子女发生肥胖的概率为41-50%，而父母双方均肥 胖者，其子女发生肥胖的概率增为66-80%。过去有关候选基因的大量研究已经表明，大多 数基因与人类脂肪组织中肥胖的发生相关。与人体体质量相关的40%以上的基因变异可以 产生遗传差异。随着分子遗传学的进展，人们发现肥胖是多基因遗传病，许多国家都在开展 肥胖候选基因研究，到目前为止已经发现600余种基因位点与肥胖症的发生有关，得到广 泛证实的与体重调节密切相关的基因主要包括体脂量和肥胖症相关（/T仍基因、瘦素受体 (Z例?)基因、载脂蛋白EU/观）基因、黑皮质素-4受体（iCW)基因、解偶联蛋白（优恐） 基因、β3-肾上腺素能受体UZWSJ)基因、过氧化物酶增殖活化受体γ 勿基因、 基因、因、基因等。
[0003]目前国内常规用于肥胖症基因变异的主要检测方法是限制性片段长度多态性法 (RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)，其原理是当变异影响到某一限制 性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的 方法。但是这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点。也有利用PCR结合DNA测 序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个 位点的应用受到一定限制。因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的肥胖易感基因 SNP分型方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
[0004]SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，包括三个基本步 骤：扩增、引物延伸和分析。
[0005] 用单一PCR或多重PCR扩增包括SNP位点在内的区域，然后向最初反应管或板孔 中直接加入核酸外切酶（Exonuclease，Exo)消化单链引物，以及奸-碱性磷酸酶（Shrimp AlkalinePhosphatase，SAP)消化未结合的dNTP底物。去除引物和dNTP，可有效避免其在 随后引物反应中的干扰。在ExoSAP酶处理后的PCR产物中加入SNP延伸产物、四种荧光标 记的ddNTP混合物以及聚合酶共同完成引物延伸，最后用GeneMapper软件进行等位基因自 动化分析。电泳检测的峰高受延伸引物的浓度影响，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延 伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、 克隆和鉴定，具有快速、简便、高通量的特点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对目前中国人群肥胖易感基因SNP位点的特点，选择有密切相 关性的12个SNP位点作为筛查目标，弥补目前现有SNP分型筛查方法的不足，提供一种简 单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的肥胖易感基因SNP位点分型试剂盒及其使用 方法。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案是：一种中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂 盒，该试剂盒包括以下内容： (1) PCR反应试剂：包括10XPCR缓冲液、Mg2+离子、底物dNTP、FastTaq酶，SNaPshot 混合液； (2) 按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引 物和反向引物； (3) 按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物； (4) PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶及其配套的缓冲液； (5) 对照标本：包括单个SNP位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本； 所述试剂盒以尸76基因rs9939609位点和rs8050136位点、货基因rsll37100 位点、4/??'基因rs429358位点和rs7412位点、基因rsl7782313位点、优7泛基 因rs660339位点、也况似基因rs4994位点、因rsl801282位点、基因 rsl0938397位点、從因rs29941位点、基因rs3101336位点共12个位点为检 测对象，针对每个SNP位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个SNP位点进行 多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获得12个SNP位点的基因型； 所述尸7?基因rs9939609位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -CTGGCTCTTGAATGAAATAGGA-3' 和 5' -GTCACACTCAGCCTCTCTACCA-3' ； 所述尸7?基因rs8050136位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -TGTGACAGTGCCAGCTTCAT-3' 和 5' -CACCAAGATGGTCATGTCTGAT-3' ； 所述基因rsl137100位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -TTGCCTGCTGGACTCTCAA-3' 和 5' -AGAGATATTCCTTGCCTGAAGA-3' ； 所述乂/??'基因rs429358位点扩增的正向引物和反向引物与所述也似5'基因rs7412位点扩增的正向引物和反向引物相同，均是5 ' -CTGATGGACGAGACCATGAAG-3 '和 5' -TCGGCGTTCAGTGATTGTC-3' ； 所述基因rsl7782313位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -AGGCTCTGCTCTGTGTCTCTT-3' 和 5' -CTTCTGGAGGCAGGTTCTGT-3' ； 所述优基因rs660339位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -CATCGCAGATCTCATCACCT-3' 和 5' -TGCTCCATACTCACGCTCAG-3' ； 所述也堪因rs4994位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -CTCTCATGCCTTGCTGTC-3' 和 5' -GGTTGGTCACAGCCAGGTA-3' ； 所述因rsl801282位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -GACAGTGCCAGCCAATTCA-3' 和 5' -TGAACGCGATAGCAACGAG-3' ； 所述基因rsl0938397位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -TCTGTGCAGAGATGGCTGAT-3' 和 5' -GTGGTGATTCCACTGGCATA-3' ； 所述從7/775?因rs29941位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -TCATGCCTGGATGCACAAC-3' 和 5' -GATCTCACAACCAGCGAGTTC-3' ； 所述基因rs3101336位点扩增的正向引物和反向引物是 5' -CCACGTAAAAGCCTGTCAGA-3' 和 5' -TGACCAGGGATGGAGCTATG-3' ； 所述/Τβ基因rs9939609 位点的延伸引物是（T) 13AGAGACTATCCAAGTGCATCAC; 所述/Τβ基因rs8050136位点的延伸引物是⑴22TTGCCCACTGTGGCAAT; 所述 基因rsll37100 位点的延伸引物是（T)23TGCAGACAACATTGAAGGAA; 所述4/??'基因rs429358位点的延伸引物是（T)3QCGGACATGGAGGACGTG; 所述4/??'基因rs7412位点的延伸引物序列是⑴34CCGATGACCTGCAGAAG; 所述 基因rsl7782313 位点的延伸引物是（T)33TAAAGCAGGAGAGATTGTATCC; 所述优恐基因rs660339位点的延伸引物是⑴43CCAGTGCGCGCTACAG; 所述也堪因rs4994位点的延伸引物是（T)44GTCTGGAGTCTCGGAGTCC; 所述 因rsl801282 位点的延伸引物是（T)46CTGGGAGATTCTCCTATTGAC; 所述 基因rsl0938397 位点的延伸引物是（T)49TGCTAAGAACATTCTTGAAAAC; 所述從因rs29941 位点的延伸引物是（T)55TGACCTCTGCAGACCTAGGA; 所述 基因rs3101336 位点的延伸引物是（T)56AAGAAAGCAATGACTGAACTTAG。
[0008] 本发明的进一步技术方案是：所述针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重 PCR扩增的正向引物和反向引物的终浓度为0. 1μΜ。
[0009] 所述针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物的终浓度分别为： /7^基因rs9939609 位点为 0.20μΜ;/Τβ基因rs8050136 位点为 0.10μΜ; 基因rsll37100位点为(λ20μΜ;也似5'基因rs429358位点为(λ10μΜ;也似5'基因rs7412位 点为0.15以]?;#<7你基因^17782313位点为0.25 4]\1;优7泛基因^660339位点为0.15 μΜ;也堪因rs4994位点为0· 25μΜ 因rsl801282位点为0· 20μΜ; 基因rsl0938397 位点为 0. 30μΜ;從因rs29941 位点为 0. 20μΜ; 基因 rs3101336 位点为 0.25μΜ。
[0010] 本发明的另一技术方案是：上述中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒的使用 方法，包括以下步骤： (1) 10个肥胖易感基因12个SNP位点进行单对引物PCR扩增； (2) 10个肥胖易感基因12个SNP位点分为3组进行多重PCR扩增； (3) 多重PCR扩增产物纯化； (4) 分为2组进行SNaPshot延伸反应优化； (5) 延伸产物纯化； (6) 分为2组在ABI3730测序仪上进行扫板分析和GeneMapperID-XVersion1.4软 件数据分析。
[0011] 本发明使用PrimerPremier5引物设计程序(加拿大PREMIER生物软件公司提 供软件）协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的12个SNP位点得到扩增富集。 PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100~200bp的距离引物设计的起始位点，引物 与序列匹配的特异性更好，引物间退火温度要尽量一致，且保持在55°C左右，使在一个多重 PCR反应中的各个扩增效率相当。11个扩增片段包含所要检测的12个SNP位点，分为三组： A组包括/7?基因rs993