一种用于hla基因分型的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒和方法，具体设及一种用于HLA基因分型的试剂盒和方 法。
【背景技术】
[0002] 现已有PCR扩增联合Sanger测序对HLA基因进行分型的方法。W HLA-B基因分 型为例，该方法的实现方案：首先，设计特异性引物扩增HLA-B基因的2号和3号外显子，为 了避免引物的偏倚性，一般会设计多对引物。其次利用sanger测序技术对PCR产物进行测 序，获得含有双等位基因信息的测序结果。再者通过公司专用的软件（技术参数保密）对 数据进行分析，从而获取样本的HLA-B分型结果，分辨率4-6位不等。
[000引上述技术的缺点有下面几点（W HLA-B基因分型为例）：1、PCR特异性引物方面： 现有的引物设计比较繁杂，需要多对引物进行扩增单一外显子，成本高，增加实验的复杂 度。2、分型准确率方面：只依赖2、3号外显子序列信息进行分型，分型结果分辨率低。3.数 据分析：公司的分型软件技术参数保密，不能够对其采取的策略进行评价和优化。
[0004] 导致上述缺点的原因：1、设计多对引物进行PCR扩增目的片段，是因为设计者未 充分利用lOOOgenome和UCSC网站上snp数据库的信息，设计无偏倚性扩增的引物。2、只 依赖2、3号外显子序列信息进行分型，是因为设计者没有考虑周全，忽视了HLA-B基因其他 外显子也会影响分型结果。3、数据分析技术参数保密，是因为公司需要通过该软件进行营 利运转，我们无法获取技术参数，因此也没有办法去评价。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于HLA基因分 型的试剂盒，本发明还提供了一种HLA基因分型的方法。
[0006] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于HLA基因分型的试剂盒，所述试剂 盒包括用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA-B基因的 4号外显子的引物；
[0007] 所述用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示的引物序列组成的扩增引物对；
[000引所述用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物包括由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物序列组成的扩增引物对。
[0009] 本发明还提供了一种HLA基因分型的方法，所述方法包括：
[0010] (1)提取待测样本的DNA;
[0011] 似分别采用由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物序列组成的扩增引物对 和由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物序列组成的扩增引物对，对待测样本DNA进 行PCR扩增，得到含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B 基因的4号外显子的第二扩增片段，然后分别纯化含有HLA-B基因的2号外显子和3号外 显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段；
[0012] (3)将步骤（2)纯化后的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行测序；
[001引 （4)将步骤（3)中的测序结果与数据库中HLA基因的外显子标准序列进行对比，确 定HLA基因的型别。
[0014] 优选地，所述步骤（4)中数据库为国际组织IMGT数据库。
[0015] 优选地，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则将步骤（2)中的第一扩增片段 和第二扩增片段分别进行T-A克隆，然后进行测序比对，确定HLA基因的型别。
[0016] 优选地，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则针对步骤（2)中的第一扩增片 段和第二扩增片段分别设计allele特异性的引物进行区分，然后进行扩增后测序比对，确 定HLA基因的型别。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒和一种 HLA基因分型的方法，与现有技术相比，其优势：
[0018] (l)PCR特异性引物方面：现有的引物设计比较繁杂，需要多对引物进行扩增单一 外显子，成本高。针对每一个外显子本发明最多只需一对引物就可W成功扩增出无偏倚性 的目的片段。
[0019] 似分型准确率方面：本发明联合2、3、4外显子（必要时加入1和5号外显子）的 等位基因信息进行分型，与现有的只依赖2、3号外显子进行分析，分型更加准确，分辨率更 局。
[0020] (3)数据分析：本发明采用脚本从sanger测序结果中获取等位基因信息，联合 使用2、3、4号外显子等位基因信息和IMGT/HLA数据库中4007条参考序列（最新版本号 3.22.0)两两组合后的数据信息，将两者进行比对，找到对应样本的HLA-B传统分型结果， 分辨率有4-8位不等。
[0021] (4)后期处理：对一些依然模棱两可的分型结果，进一步通过T-A克隆或者设计等 位基因特异性引物加W区分，从而保证分型结果的准确性和高分辨率。
[0022] 采用本发明的分型方法和试剂盒能够使分型流程更加简单，在降低成本的同时增 加分型分辨率和准确率，从而进一步应用到科研和临床工作中去。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明所述实施例1中分型结果；
[0024] 图2为本发明所述实施例2中扩增HLA-B的2、3、4号外显子的电泳图；
[00巧]图3为本发明所述实施例2中的测序峰图。
【具体实施方式】
[0026] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0027] 实施例1
[002引本实施例WHLA-B基因分型为例，进行HLA基因分型。
[0029] 一、样本DNA的准备：
[0030]抽取 2ml全血，用试剂盒QIAampDNAMiniKitCat.No. 51304 抽提DNA，A260/280 二1· 7~2· Oo
[0031] 二、扩增HLA-B的2、3、4号外显子：
[0032] 1、扩增2号和3号外显子的引物序列：
[0033] F1:CGGGAGGGAAATGGCCTCTG(SEQ ID NO. 1)
[0034] R1: TTCAACGGAGGGCGACATTCTA (沈Q ID NO. 2)
[0035] 2、扩增4号外显子的引物序列：
[0036] F2: TGTCCTGTCCATTCTCAGGC (沈Q ID NO. 3)
[0037] R2: TTCCCTGAGAAGAGATATGACCC (沈Q ID NO. 4)
[0038] 3、PCR反应体系和条件：
[00測（1)反应体系：使用高保真DM聚合酶PrimisSTAR/.咬GXL DM Polymerase Cat. No. R050A;如下表1 :
[0040] 表1反应体系
[0041]
[004引似反应条件：
[0043]
[0044] 4、进行DNA电泳质检目的条带（片段大小符合预期、条带单一、亮度适中）
[0045] 片段大小：扩增exon2和exonS的片段1长度为lOlSbp
[0046] 扩增exon4的片段2长度为409bp
[0047] S、sanger测序：对获得的两个PCR产物片段进行sanger测序。片段1双向测序， 分别获得ex〇n2和exon3的序列信息；片段2正向测序，获得exon4的序列信息。公司会返 还油1格式的峰图文件。
[0048] 四、应用HLA专业软件进行分型：
[0049](一）将油1文件转换为含有简并形式的化sta序列文件：
[0050] 将exon2、3、4外显子的序列从测序结果中截取出来，W下面的格式合并2、3、4号 外显子的序列（/代表双峰）：
[0051] >exon2
[0057](二）、将第（一）步中获得的序列与HLA-B数据库进行两两比对，从数据库中获取 与目的序列一样的候选序列，再将候选序列两两组合获取跟目的序列完全一致的组合。该 组合就是我们要的分型结果。
[005引1.如果可W成功分型，结果会W图1的形式导出。
[005引2.输出分型结果：上图结果应为B*27:04:01 ;B*40:01。
[0060] 五、结果分析：
[0061] 1、如果结果文件为空，说明我们一开始输入的简并形式序列有错误（原因可能是 测序质量不好，有些双峰不能清晰地辨别），运种情况需要返回最初去修改含有简并形式的 fasta序列文件。
[0062] 2、如果获得的分型中含有ambiguity,我们可W做T-A克隆或者设计allele特异 性的引物进行区分。