黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用，属于分子生物 学技术领域。
【背景技术】
[0002] 黄瓜是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。利用雌性系育成的黄瓜杂交种具有早 熟、丰产的特点。另外，利用雌性系配制一代杂种，可大大降低制种成本，提高制种的纯度。 但是，由于我国缺乏相应的雌性系种质资源，利用常规育种手段把国外雌性源回交转育成 国内密刺黄瓜类型和华南型黄瓜类型的雌性系，育种周期长，费工费时。而且，黄瓜性型的 表达还受到环境条件的影响，依靠人工进行表型选择还存在不够准确的问题。运些问题的 存在，使得黄瓜雌性系的选育进展缓慢，影响了黄瓜雌性系育种的进程。而基于基因型选择 的现代分子标记辅助育种技术，可W大大提高性状选择的效率，加速育种进程。
[0003] 近年来研究发现，乙締合成基因是黄瓜性别决定的关键基因。黄瓜的乙締合成酶 基因ACS1和ACS2分别是决定黄瓜性别分化的F基因和Μ基因。另外，研究还发现黄瓜性 别表达与乙締信号应答基因如受体基因ETR1、ΕΙΝ3等的表达相关。因此，从与黄瓜雌性表 达相关的关键基因入手，筛选用于黄瓜性型鉴别的分子标记，辅助黄瓜雌性系育种具有重 要意义。
[0004] 单核巧酸多态性（singlenulceotidepolymo;rphism,SNP)是继限制性片段 长度多态性RFLP、扩增片段长度多态性AFLP和微卫星标记SSR之后的新一代分子标 记。它具有分布广、密度高、多态性丰富等特点，而且能直接反应植物基因水平上的差异。 InDel(insertion-deletion)插入缺失标记，指的是两种亲本在全基因组中的差异，相对另 一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核巧酸插入或缺失。本发明是在黄 瓜雌性系及其近等基因系重测序的基础上，开发用于黄瓜雌性系选择的SNP^nDel分子标 记。前人的研究认为，通过黄瓜基因组中ACS1拷贝数的分析，即可判断雌性与否，但也有研 究结果与此相惇。 阳0化]因此，开发新的黄瓜雌性系分子标记，对于鉴定不同来源的雌性系材料和黄瓜雌 性系的辅助选择具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及 其应用。 阳007] 本发明技术方案如下：
[0008] 黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记，均位于6号染色体上编码黄瓜乙締 合成酶基因ACSl/Csa6G496450的起始密码子上游800~1300bp区间内；
[0009] SNP1位于6号染色体的24216638bp位置，非雌性系材料为A，纯雌性材料为G;
[0010] SNP2位于6号染色体的24216699bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为T;
[0011] SNP3位于6号染色体的24216739bp位置，非雌性系材料为Τ，纯雌性材料为C;
[0012]SNP4位于6号染色体的24216776bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为A;
[0013]SNP5位于6号染色体的24216813bp位置，非雌性系材料为C，纯雌性材料为T;
[0014]SNP6位于6号染色体的24216843bp位置，非雌性系材料为CA，纯雌性材料为TG;
[0015]SNP7位于6号染色体的24216848bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为A;
[0016]SNP8位于6号染色体的24216875bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C;
[0017]SNP9位于6号染色体的24216958bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C; 阳01引InDell位于6号染色体的24216613bp位置，非雌性系材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTTT的缺失，纯雌性材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入；
[0019]InDel2位于6号染色体的24216849bp位置，非雌性系材料为GG的插入，纯雌性材 料为GG的缺失；
[0020]InDel3位于6号染色体的24216973bp位置，非雌性系材料为T的插入，纯雌性材 料为T的缺失；
[0021] InDel4位于6号染色体的24217018bp位置，非雌性系材料为TAATGG或者TGATGA 的插入，纯雌性材料为TAATGG或者TGATGA的缺失。
[0022] 检测上述SNP标记与InDel标记的检测引物，检测引物为一对，上游引物核巧酸序 列如SEQIDNO. 1所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0023] 上述SNP标记与InDel标记在黄瓜雌性系品种鉴定中的应用。
[0024] 上述应用，步骤如下： 阳0巧](1)提取待测黄瓜基因组的DNA;
[0026] 似W待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行 PCR扩增反应；
[0027](3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非 雌性系材料。
[0028] 根据本发明优选的，所述步骤似中，PCR扩增反应的反应体系为251μ1，具体如 下：
[0029]lOng/μ1 模板DNA1μ1，lOpmol/μ1 上游引物 1μ1，lOpmol/μ1 下游引物 1μ1， lOmmoVldNTRiiix0. 5μ1，TaqDNA聚合酶lU，lOXPCR反应缓冲液 2. 5μ1，余量为超纯水。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，PCR扩增反应的扩增程序为：
[0031]先进行梯度降落PCR，95°C变性30s，退火溫度从65°C降到56°C，每循环降退火溫 度1°(：，453,72°(：延伸1111111;
[0032] 然后95°(：变性3〇3,56°(：退火453,72°(：延伸1111111，20个循环；最后72°(：延伸 10min〇
[0033] 上述与黄瓜雌性相关的SNP标记与InDel标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应 用。
[0034] 有益效果
[0035]1、本发明首次发现位于编码黄瓜乙締合成酶基因ACSl/Csa6G496450的起始密码 子上游800~1300b区间处存在9个与黄瓜雌性相关的SNP标记（SNP1~SNP9)和4个 InDel标记（InDel1~InDel4)，通过任一SNP标记或InDel标记均可W鉴别出黄瓜雌性与 否。
[0036] 2、本发明所述鉴定方法可替代传统的W表型观察判断的方法，可W在黄瓜苗期和 室内进行，比在田间开花坐果期人工观察便捷，可用于大规模筛选育种材料，节约±地和成 本，大大加速黄瓜育种进程，使结果更加准确可靠。
[0037] 3、本发明通过基因组重测序分析，在黄瓜ACS1基因的上游序列中发现多个雌性 相关SNP和InDel位点，并通过一对引物的扩增就可得到运些变异位点的序列信息，而且通 过验证发现在不同雌性源材料中分析结果一致。因而，本发明能够很好的鉴定不同来源的 雌性系材料，能够用于不同来源的雌性系材料的辅助选择。
【附图说明】
[003引图1黄瓜雌性和非雌性系基因组DNA电泳检测图；
[0039]图中：1，AZ-1 ;2, BB ;3, X8-2 ;4, AlOh ;5, A8化；6, M16 ;7,YN;8, A72 ;9, ZQ3 ;10， SJ11 ;11，MC8-3 ;12, Cuilong ;13, BM28 ;14, DL102。
[0040] 图2黄瓜雌性和非雌性系PCR产物电泳图：
[0041 ] 图中：所用分子marker为化2000,共有6个条带，大小依次为2000bp, 100化P, 75 化P, 5(K)bp，25化P,l(K)bp，扩增产物对应的条带为75化P。 阳0创图3实施例1中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标 记。
[0043] 图中：M16、日本黄瓜类型的雌性源材料；BB、白黄瓜，华南类型非雌性系；AZ-1、 华北型非雌性系；X8-2为华北型的新泰密刺，非雌性系；MC8-3、X8-2回交转育的雌性 系；A86h、AZ-1回交转育的雌性系；AlOh、BB回交转育的雌性系；A72、密刺类型的雌性系； SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系；ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系；YN、华南类型黄瓜雌性 系；化ilong、华南类型黄瓜杂交种，为青岛农科院品种；DL102、华北类型杂交种，山东农科 院品种；BM28、华北类型杂交种，天津德瑞特种业有限公司。
[0044] 图4实施例2中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标 记。
[0045] 图中：Zhongnong26为华北类型杂交种；Qingyan2,华南型杂交种；Jinchun2,密刺 类型杂交种Jinyou35,密刺类型杂交种。
[0046] 图5实施例1所述为X8-2开花期照片，为田间观察结果；
[0047] 照片显示雄花多于雌花，证明样品为非雌性材料；
[0048] 图6实施例1所述为雌性源M16开花期照片，为田间观察结果；
[0049] 照片显示该植株节节着生雌花，证明样品为纯雌性材料。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0051] 检测品种来源：
[0052] M16、日本黄瓜类型的雌性源材料，来源于国家种质库；
[005引 BB、白黄瓜，华南类型，来源于山东海阳地方品种；
[0054] AZ-1、华北型，来源于山东地方品种； 阳化5] X8-2、华北类型，来源于新泰密刺黄瓜；
[0056]MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；
[0057] A86KAZ-1回交转育的雌性系； 阳化引A10h、BB回交转育的雌性系；
[0059] A72、密刺类型的雌性系，来源于山东农科院蔬菜花弁研究所；
[0060] SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系，来源于波兰农科院；
[0061] ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系，来源于德瑞特种业有限公司；
[0062]YN、华南类型黄瓜雌性系，来源于山东农科院蔬菜花弁研究所；
[0063] 化ilong、华南类型黄瓜杂交种，来源于青岛农科院；
[0064] 化102、华北类型杂交种，来源于山东农科院； 阳0化]BM28、华北类型杂交种，来源于天津德瑞特种业有限公司；
[0066] Zhon即ong26、华北类型杂交种，来源于中国农科院； 阳067] Qingyan2、华南型杂交种，来源于青岛农科院；
[0068]Jinchun2、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种；
[0069]Jinyou35、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种。
[0070] 上述品种均为现有已知品种。 阳0川 实施例1
[0072] 2014、2015两年夏季分别种植纯雌系材料8个（410}1，48化-1，]\116,472,293,5111， MC8-3,YN)、非雌性材料 3 个（AZ-1，BB，X8-2)及杂交种 3 个（Cuilong，BM28,DL102)，取性 型稳定的纯雌性材料和非雌性材料及杂交种的幼嫩叶片进行DNA提取，然后进行PCR扩增 和分子标记检测分