ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，尤其设及ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检 测引物与试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌（CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内，CRC在男性和女性中的 发病率分别处于恶性肿瘤发病率的第Ξ位和第四位，死亡率分别位居第四位和第五位。近 年来，我国CRC发病率呈明显上升趋势，在沿海发达地区及大中城市尤为明显。据统计，我 国年均新发CRC病例达13万，约占全身肿瘤的12%~15%，并W年均4%增幅不断攀升。 由于其发展迅速、恶性程度高、治疗困难，CRC越来越受到医学界特别是国内医学界的重视， 使其成为基础研究和临床研究的重大课题。
[000引 由于CRC早期诊断率低，约60%的初发术后或复发转移患者需接受系统化疗。目 前临床用于治疗CRC的一线化疗药物有5-氣尿喀晚巧-FU)、卡培他滨、奥沙利销等。然而， 运些药物由于生物利用度个体差异很大，导致其疗效存在明显的个体差异，即使是联合使 用其总体有效率也仅为30~40%
[0004] 药物疗效的个体差异一直是临床常见的现象，也是临床医师关注的问题之一。癌 症患者接受化疗时表现出的运种差异尤为明显，不同患者接受相同剂量强度的化疗药物后 可能产生不同的反应，从有效到无效，甚至产生严重不良反应。药物发挥生物活性必须先 进入祀细胞，而表达在祀细胞上的转运体对药物的转运直接关系到药物能否有效进入祀细 胞，达到有效浓度。肠道作为口服药物最重要的吸收器官，分布着大量的药物转运体。运些 转运体的诱导或抑制都将严重影响药物的疗效。 阳0化]业已证实，作为人类最常见的一种基因变异，SNP在药物反应个体差异中起着极其 重要的作用，是决定药物敏感性的主要因素之一，其与药物敏感性之间的关系及其功能意 义也逐渐被人们所认识。随着研究的不断深入，越来越多的研究发现，位于转运体基因3' 非编码区（3' -UTR)内存在的基因多态性（SN巧能够通过影响蛋白表达调控的关键因子 microRNAOniRNA)的调控，从而影响转运体蛋白表达水平。 阳006] ABCC4定位于人类染色体13q32,有1325个氨基酸组成，属于ABC转运蛋白中的ABCC亚家族。ABCC4基因多态性位点rs3742106是位于ABCC4基因3'-UTR上的SNP位点， 目前，尚无研究表明，ABCC4基因的多态性位点rs3742106与化疗药物的疗效相关。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供ABCC4基因多态性位点rs3742106 的用途及其检测引物与试剂盒，本发明提供的引物具有良好的特异性，能够实现对ABCC4 基因多态性位点rs3742106的准确检测，从而实现对结直肠癌化疗疗效的准确预测。
[0008] 本发明提供了ABCC4基因多态性位点rs3742106在制备预测结直肠癌化疗疗效的 产品中的应用。
[0009] 在本发明的实施例中，化疗的药物为奥沙利销、5-氣尿喀晚、卡培他滨中的一种或 两者W上的组合。
[0010] 所述的疗效是指结直肠癌患者经化疗后临床症状是否缓解，根据化疗后CT结果 及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价： 阳011] 完全缓解（completeremission,CR):所有目标病灶消失，至少维持4周；
[0012] 部分缓解（partialremission,PR):基线病灶最大径之和至少减少30%，至少维 持4周；
[0013] 病情稳定（steadydisease,SD):基线病灶最大径之和减少不足30%或增大不足 20% ;
[0014] 病情进展（progressdisease,PD):基线病灶最大径之和至少增加20%或出现新 病灶。
[0015] 化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
[0016]ABCC4基因多态性位点rs3742106存在3种基因型，分别为AA、CC、CA，本发明对 277例结直肠癌病人进行调查，当完成4个月的治疗后，其中，137例患者疗效好，140例患者 疗效差。对277例结直肠癌患者的ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分 布符合Hardy-Weinburg平衡。经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠 癌化疗疗效显著相关，根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基 因型为AA时，预测结直肠癌患者的化疗效果好，基因型为CC或CA时化疗效果差。
[0017] 本发明还提供了扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物组，包括SEQID NO: 1~8所示核巧酸序列的引物中任意二条或二条W上的引物。 阳01引其中，用于扩增rs3742106多态性位点的引物为SEQIDNo. 1~3,其核巧酸序列 为：
[0019]SEQIDNo. 1 :5，-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3,；
[0020] 沈QIDNo. 2 :5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3' ；
[0021] 沈QIDNo. 3 :5'-AGTCCGTTCCGAAGGCAATT-3' ；
[0022] 用于单碱基延伸的引物为SEQIDNo. 4,其核巧酸序列为：
[0023]沈QIDNo. 4 :5'-AGTCCGTTCCGAAGGCATTT-3'；
[0024] 用于扩增等位基因的特异性引物为SEQIDNo. 5~8,其核巧酸序列为： 阳0巧]SEQIDNo. 5 :5，-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3,；
[0026]沈QIDNo. 6 :5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3';
[0027]沈QIDNo. 7 :5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'；
[0028]沈QIDNo. 8 :5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'。
[0029] 通常，用于检测基因多态性位点的方法有单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法、DM测序 法、限制性片段长度多态性分析法、等位基因特异性扩增法、四引物扩增法。运些方法的灵 敏性和准确性皆基于引物的特异性，本发明提供的引物能够具有良好的特异性，能够实现 对ABCC4基因多态性位点rs3742106的准确检测。其检测样品为全血的基因组DNA。
[0030] 本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
[0031] 沈QIDNO: 1所示核巧酸序列的上游引物、
[0032]SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物和 阳03引 SEQIDNO:4所示核巧酸序列的单碱基延伸引物。
[0034] 该试剂盒可通过单碱基延伸-MALDI/T0F/MS法对多态性位点rs3742106进行检 测。
[0035] 该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2\dNTP和化qDNA聚合酶。
[0036] 该试剂盒中还包括：SAP酶。
[0037] 该试剂盒中还包括JPLEX反应液。
[0038] 本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法 通过单碱基延伸-MALDI/T0F/MS法对ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型进行检测， 具体包括W下步骤：
[0039] 步骤1:W待测样品的基因组DNA为模板，WSEQIDNO: 1所示核巧酸序列的上游 引物和SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0040] 步骤2 :扩增产物经纯化后，WSEQIDNO: 4所示核巧酸序列的单碱基延伸引物进 行延伸，获得延伸产物；
[0041] 步骤3 :延伸产物经纯化后，WMLDI/T0F/MS测定ABCC4基因多态性位点 rs3742106的基因型。
[0042] 本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
[0043]SEQIDNO: 1所示核巧酸序列的上游引物和
[0044]SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物。
[0045] 该试剂盒可通过DNA测序法对多态性位点rs3742106进行检测。
[0046] 该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2\dNTP和化qDNA聚合酶。
[0047] 该试剂盒中还包括：SAP酶。 W48] 本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法 基于DNA测序法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，具体包括W下步骤： W例步骤1 :W待测样品的基因组DNA为模板，WSEQIDNO: 1所示核巧酸序列的上游 引物和SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0050] 步骤2 :扩增产物纯化后，经测序获得ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因 型。
[0051] 本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
[0052] SEQIDNO:3所示核巧酸序列的上游引物和 阳05引 SEQIDNO:2所示核巧酸序列的下游引物。
[0054] 该试剂盒可通过限制性片段长度多态性分析法对多态性位点rs3742106进行检 测。 阳化5] 该试剂盒中还包括：Mfel酶或Muni酶。
[0056] 该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2\dNTP和化qDNA聚合酶。
[0057] 本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法 基于限制性片段长度多态性分析法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，具体包 括W下步骤： 阳化引步骤1 待测样品的基因组DNA为模板，WSEQIDN0:3所示核巧酸序列的上游 引物和SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0059] 步骤2:扩增产物W限制性内切酶消化后，经凝胶电泳分离，根据片段大小获得 ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型；
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