鉴定巴马火麻性别的方法及其分子标记、引物对和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种鉴定己马火麻性别的方法及其使用的分 子标记、引物对和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 己马火麻，因产于广西己马而得名，其是大麻科大麻属大麻种（Cann油issativa L.)下的一个亚种，雌雄异株，一年生草本植物。己马火麻是四氨大麻酪（Τ肥）含量低于 0.3% (不足W危害人体）的大麻品种类型。随着己马火麻市场需求量的大幅攀升，己马火 麻种植面积也不断扩大，但产量较低，只有300-450Kg/hm2。研究发现，己马火麻雌雄异株W 及雌雄比例不当是导致低产的主要原因。己马火麻主要是W收获果实为主，雌株经济价值 显然高于雄株，然而随机播种后田间雌雄株比例一般为1:1。因此，若要提高己马火麻种子 的产量，如何适当增加雌株的比例成为关键。己马火麻雌雄株在苗期表型上没有差别，其早 期性别鉴定存在很大困难，只能在成株阶段，根据花器官的表型进行性别鉴定。然而，己马 火麻成株阶段的性别鉴定对于己马火麻产量的提高是于事无补的。因此，如何提高田间雌 雄株比例，苗期的性别鉴定成为关键因素。鉴于上述情况，目前很有必要寻求一种在苗期即 可进行且准确可靠的鉴定己马火麻性别的方法，W提高己马火麻的产量。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了提高己马火麻的产量，方便在苗期即可对其进行性别鉴定及 雌雄株的管理，而提供一种鉴定己马火麻性别的方法及其使用的分子标记、引物对和试剂 盒。
[0004] 本发明提供的技术方案之一是：一种用于鉴定己马火麻性别的分子标记，其是核 巧酸序列如SEQIDNO. 1所示的DNA分子。
[0005] 本发明所述的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示的DNA分子，是来源于雄性己马火 麻的种特异性分子标记，可W用于特异性鉴定己马火麻植株的性别。
[0006] 本发明提供的技术方案之二是：一种用于扩增前述分子标记W鉴定己马火麻性别 的引物对，其包括核巧酸序列如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示的引物。
[0007] 本发明的引物对，能够对雄性己马火麻植株扩增出核巧酸序列如SEQIDNO. 1所 示的DM片段，而雌性己马火麻植株不能够扩增出此片段，因而可W在苗期即对己马火麻 植株进行准确可靠的性别鉴定。
[0008] 本发明提供的技术方案之Ξ是：一种用于鉴定己马火麻性别的试剂盒，其包括前 述引物对，即核巧酸序列如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示的引物。
[0009] 优选地，所述试剂盒还包括DM聚合酶、Mg2\dNTP、PCRBufferW及无菌水中的一 种或多种。所述PCRBuffer为本领域进行PCR反应常规使用的Buffer。
[0010] 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为雄性植株的 基因组DNA，所述阴性对照为雌性植株的基因组DNA。
[0011] 本发明提供的技术方案之四是：一种鉴定己马火麻性别的方法，其包括如下步 骤：
[001引（1)提取待检己马火麻的基因组DNA;
[001引似W步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，W核巧酸序列如SEQIDNO. 2和SEQ IDNO. 3所示的引物对为扩增引物进行PCR反应；
[0014] (3)检测步骤（2)所得的PCR反应产物W进行结果判断，所述结果判断的标准为， 若PCR反应产物中存在1436bp的目标条带，则对应待检己马火麻的植株为雄性植株，若PCR 反应产物中不存在1436bp的目标条带，则对应待检己马火麻的植株为雌性植株。
[0015] 本发明中，步骤（1)所述提取待检己马火麻的基因组DNA的方法可W是本领域常 规，即一般的植物基因组DNA的提取方法均适用。对于待检植株的取材部位没有特别要求， 与其他植物提取基因组DNA的操作要求基本相同，即选取根、茎或叶均可，一般而言，取叶 片部位操作较为常见。
[001引优选地，步骤（1)所述提取待检己马火麻的基因组DNA的方法为CTAB(hexade巧Itrimeth^ammoniumbromide,十六烷基Ξ甲基漠化锭）法，具体操作可参 考文南犬"AllenGC,Flores-Ver邑araMA,KrasynanskiS,KumarS,ThompsonWF.Amodified protocolforrapidDNAisolationfromplanttissuesusingcetyltrimethy 1ammoniumbromide.化tProtoc, 2006,1 巧）：2320-2325"进行。
[0017] 本发明中，步骤（2)所述的PCR反应的反应体系和反应程序可w是本领域常规，并 没有特别的限制，只要其能够使PCR扩增反应正常进行即可，即通常的基因组DNAPCR扩增 反应的反应体系和扩增程序都适用。
[001引优选地，步骤似所述PCR反应的反应体系包括1-3XBuffer、l-3ng/μL的 基因组DNA、0. 2-0. 4μΜ的上游引物、0. 2-0. 4μΜ的下游引物、0. 2-0. 4mM的dNTP和 0. 025-0. 05U/μL的Taq酶。步骤似所述PCR反应的反应程序包括如下子步骤： ① 94-95 °C、3-5min，② 94-95 °C、28 ~35s，③ 53-63 °C、28-35S，④ 72 °C、28-35S，⑥ 72 °C、 5-15min，其中，子步骤②~④为30~40个循环。
[0019] 更优选地，步骤（2)所述PCR反应的反应体系包括1XBufferJng/μL的基因组 DNA、0. 3μΜ的上游引物、0. 3μΜ的下游引物、0. 2mM的dNTP和0. 05U/μL的Taq酶。步骤 (2)所述PCR反应的反应程序包括如下子步骤：①95°C、3min，②94°C、30s，③58°C、30s， ④72°C、30s，⑥72°C、lOmin，其中，子步骤②~④为35个循环。
[0020] 本发明中，步骤（3)所述检测步骤（2)所得的PCR反应产物可W使用本领域常规 的检测方法，并没有特别的限制，一般的检测PCR反应产物的方法均适用。
[0021] 优选地，步骤（3)所述检测步骤（2)所得的PCR反应产物的检测方法为琼脂糖凝 胶电泳并进行紫外成像。
[0022] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0023] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0024] 本发明的积极进步效果在于：
[00巧]本发明的用于鉴定己马火麻性别的分子标记特异且稳定，只存在于雄性己马火麻 植株中，此前从未被报道过，是一个新的分子标记。本发明的PCR引物、其试剂盒可W用于 鉴定己马火麻的性别，且在苗期就可w进行，从而有利于在植株小的时候就人为的控制己 马火麻雌雄植株的比例W达到提高己马火麻产量的目的。本发明的鉴定己马火麻性别的方 法操作简单、成本低廉，利于在实际生产中推广应用，具有很高的商业价值。
【附图说明】
[0026] 图1为ISSR839引物在己马火麻雌雄单株中多态性的分布图，其中，图la为雌株 (毕）的结果，图化为雄株（?)的结果。
[0027] 图2为实施例1中280对SRAP引物对之中的24对SRAP引物在雌雄DNA池中多 态性的分布图。
[0028] 图3为实施例1中对mell/eml2引物组合进行单株验证的部分结果图，其中，Μ为 DL5000Marker, 1-5为雄株（A)的结果，6-10为雌株（毕）的结果。
[0029] 图4为实施例1中对特异引物对HXF/HXR进行验证的部分结果图，其中，Μ为 DL5000Marker, 1-5为雌株（毕）的结果，6-10为雄株（A)的结果。
【具体实施方式】
[0030] W下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。本发明中，除特殊说 明的之外，所有设备和试剂均常规市售可得。
[0031] 下述各实施例中所使用的己马火麻植物材料为火麻的己马地方品种"己马火 麻"(Cann油issativaL.subssp.sativa)。引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公 司完成，测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
[0032] 下述实施例中，使用的引物及对应序列表的编号如表1所示：
[0033] 表1引物名称、其序列组成及对应序列表中的编号
[0034]
[0035]
[003引实施例1己马火麻性别鉴定SCAR分子标记 ' '
[0037] (1)在己马火麻开花期，分别选择雌雄花器官典型的雌雄单株各15株，然后摘取 单株的嫩叶2-3片并依次编号放入取样冰盒中，带回实验室后转入-80°C的冰箱进行保存。[003引 似采用CTAB方法，分别提取雌雄单株的总DNA，参考加拿大哥伦比亚大学设计 并公布的ISSR引物（其网址为ht1:p://www.biosci.ohio-state.edu/ ~awolfe/lSSR/protocols.ISSR.html)，选择ISSR839 引物灯ATATATATATATATARG)对每个单株进行PCR扩 增。结果显示，ISSR839引物在己马火麻雌雄单株中多态性丰富；该引物在雌性单株或雄性 单株之间扩增的条带不一致，说明雌性或雄性单株之间遗传基础存在差异（图1)。因此，根 据扩增结果分别选取6株扩增条带一致即遗传背景相同的雌性（图la中箭头标示所代表 的植株）或雄性单株（图化中箭头标示所代表的植株）的DNAW等量混合构建雌雄性别 DNA池。
[0039] 做分别W己马火麻雌雄DNA池为模板，利用已经报道的SRAP引物（可参考论文 "红麻雄性不育细胞质的分子标记及种质资源遗传多样性分析，牛英，博±学位论文，广西 大学，2008，P28")，从中选择了 14个正向引物（mel-mel4)和20个反向引物（eml-em20)组 配成280对引物，采用运280对SRAP引物组合进行PCR扩增。其中，PCR反应的反应体系 为20μL，体系中包括40ng的混合DNA，上、下游引物各0. 3μM，2μL的10XBuffer, 0. 2mM 的dNTP，lU的化qplus,用水补足至20yL。PCR反应的反应程序为：95°C预变性3min， 94°C30s，58°C30s，72°C30s，扩增35个循环，72°C延伸lOmin。PCR反应结束后，将扩增获 得的PCR产物采用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，280对引物中共有24对 引物在雌雄DNA池中表现出明显的差异（见图2)。运24对引物分别是mel/emlO,me2/em 1，me3/em15,me3/em20,me4/em3,me4/emll，me4/eml4,me5/em5,me6/eml，me7/em3,me?/ eml8,me7/eml9,me8/eml3,me9/em3,me9/em6,mel0/em4,mell/eml2,mell/em7,mel2/eml， mel2/em8，mel3/em3，mel3/em5，mel4/em3，mel4/em9。图 2 中的差异条带如箭头所不，选择 雌雄差异条带亮、单一性好且产量高的引物组合mell/eml2进行单株验证和序列克隆。
[0040] (4)雌雄DNA池间性别差异条带单株检测
[0041] 选择在雌雄DNA池间扩增出的差异条带亮、单一性好且产量高的引物组合（mell/ eml2)进行雌性单株和雄性单株验证。实验分别选取了 10株雄性和10株雌性己马火麻进 行单株验证，结果显示，所有的雄性单株均能稳定的