专利名称：与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记及其获得方法
技术领域：
本发明涉及与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增(SequenceCharacterized Amplified Region，SCAR)标记及其获得方法。
背景技术：
大白菜原产于我国，是深受我国人民喜爱的蔬菜之一。中国大白菜的特点是种质资源丰富，生态类型多样，分布面积广，产量高，耐贮运，供应期长，食用方法多样，种植简易、省工、成本低、价格低廉，在我国菜篮子中占重要地位，大白菜生产的好坏直接影响蔬菜市场供应和人民生活，是名副其实的大众化蔬菜。随着生产力的发展和人民生活水平的不断提高，大白菜品质育种日益受到国内外学者的重视。白菜品质包括商品品质、风味品质和营养品质。商品品质指外观形态、色泽、包球方式、个体大小、整齐度与结球紧实度等。随着商品经济的发展、商品品质的重要性将与日俱增。风味品质和营养品质对消费者食用更具实际意义。风味品质包括生食脆嫩、味甜、熟食味鲜，易煮烂；营养品质则主要是指白菜内含营养成份的多少，如蛋白质、糖、氨基酸、维生素、纤维素(膳食纤维)、矿物元素等。随着人民生活水平的提高，人们对风味品质和营养品质的要求也会愈来愈高。大白菜球色育种(黄心和桔红心品种的选育)是品质育种的研究内容之一。北京市农林科学院蔬菜研究中心1990年开始进行桔红心类型白菜品种的选育工作，结合游离小孢子培养和人工接种抗病性鉴定筛选技术，1996年“北京桔红心”品种选育成功，“一种桔红心白菜的选育方法”2002年获国家发明专利(专利号为ZL 99 1 03404.X)。
在大白菜球色育种过程中我们发现，大白菜桔红心球色为单隐性基因控制的简单遗传。以往，球色的鉴定必须要在收获期剖球进行。为提高选择效率和加快选育进程，研发与桔红心性状连锁的分子标记，建立桔红心性状分子标记辅助育种系统非常必要。利用与育种目标性状紧密连锁的分子标记，对目标性状进行跟踪选择，称为分子标记辅助育种。目前，用于辅助育种的分子标记主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA或简单重复序列(SSR)等。在以上几种标记中，RAPD标记是通过任意引物产生的基于PCR的分子标记，由于其具有简单易行，需要模板DNA量少(一般15-25ng)，引物是随机设计的具有通用性的优点，受到广大研究者的欢迎，并且在种质资源的鉴定与分类、目标性状基因的标记、遗传图谱的构建等方面得到广泛应用。但RAPD标记有以下缺点1)标记是显性标记，不能区分杂合型和纯合型；2)由于它使用短引物(9-10个碱基)和低退火温度(36-42℃)并允许碱基误配，RAPD检测易受环境条件的影响，重现性差。为了解决这些问题，Paran和Michelmore建立了SCAR(Sequence Characterized Amplified region，特异序列扩增)标记方法。SCAR标记引物通常是20个碱基左右的寡聚核苷酸，一般由RAPD标记的扩增产物克隆和测序后获得，SCAR标记现已成为将RAPD标记转化为可以实际应用的稳定的标记工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种与白菜桔红心性状紧密连锁的SCAR标记，该SCAR标记可用于桔红心分子标记辅助育种中。
本发明的另一个目的是提供这种SCAR标记的获得方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增(SCAR)标记，其具有序列表中SEQ ID NO1所述DNA序列。
一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增(SCAR)标记的获得方法，所述方法包括如下步骤1)与桔红心连锁的特异随机扩增多态性DNA(RAPD)标记的筛选提取基因组DNA，使用RAPD随机引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与桔红心性状连锁的RAPD标记，测定连锁距离并验证连锁关系；2)与桔红心连锁的特异SCAR标记的获得对RAPD产物进行回收、克隆和测序，根据测序结果的两端序列设计引物对，长度20个碱基，用SCAR引物进行PCR扩增反应，对反应产物进行电泳分析，测定连锁距离并验证连锁关系。
所述步骤1)中的提取基因组DNA是指将1.5克去掉叶柄的叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
所述步骤1)中的PCR反应条件是25μl的反应体系中含有2.5μl10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ngRAPD随机引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循环45次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。
所述步骤2)中RAPD产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的RAPD标记，然后连接到pGEM@-T Vector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用RAPD-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。
所述步骤2)中的PCR扩增反应的条件是25μl的反应体系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1.0μl Primer 1，1.0μlPrimer 2，2.0μl模板DNA和0.2μl TaqE；SCAR-PCR的反应程序为94℃预变性5min 然后94℃变性1min 37℃退火1min 72℃延伸2min 35个循环；再在72℃延伸7min，4℃保存。
所述步骤2)中的测定连锁距离并验证连锁关系是指对DH株系DNA用SCAR引物进行PCR扩增，根据扩增结果和植株的表型性状测定连锁关系，应用Mapmaker Ver.3.0计算遗传距离。
所述SCAR引物为5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’和5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’。
本发明应用随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术，在以小孢子培养建立的大白菜双单倍体(Doubled Haploid，DH)群体中采用混合分组分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)筛选了与桔红心基因连锁的RAPD标记，并将RAPD标记转为稳定的SCAR标记。
本发明的优点是本发明获得的SCAR标记具有分析程序简单、反应周期短、所需DNA量极少(一般为5-25ng)且质量要求不苛刻；设备简单，只需1台PCR仪就可进行；与其他标记类型相比，成本低，重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明。
图1为引物OPB01对两亲本、两池及池中各DH单株DNA扩增结果2为引物SCB01对DH群体的SCAR标记扩增结果图
具体实施例方式
实施例1、与大白菜桔红心性状紧密连锁的SCAR标记的获得一.材料和方法1.1材料供试材料为大白菜普通白心株系91-112和桔红心株系T12-19。两材料均由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。91-112为连续自交筛选9代的高代自交系，球心色为白色，叶面较平，叶球叠抱。T12-19是通过对北京地方品种和日本引进品种的杂种F1进行小孢子培养得到的双单倍体系，球心色桔红色，叶面皱，叶色深绿，植株生长势弱。对91-112和T12-19的F1进行小孢子培养，得到100个双单倍体株系，用于分子标记研究。为进一步验证获得的标记，还采用了桔红心99-63与白心99-2产生的78株F2单株，此78个单株已经F3代验证球色不发生分离，其中42株为桔红心，36株为白心。
1.2研究方法1.2.1与桔红心连锁的特异RAPD标记的筛选1.2.1.1基因组DNA的提取参照Murry等(1980)的方法(Murray M，Thompson W F.Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res，1980，8668-673.)加以改进后进行DNA提取。
将1.5克去掉叶柄的叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀，冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液(76％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干，加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
DNA浓度用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定，并用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。
1.2.1.2 PCR扩增与产物的检测25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng引物，50ng模板DNA。RAPD随机引物、dNTP与100bp Marker购自Sangon公司，为便于国际交流，把Sangon系列引物编号转换为Operon系列引物编号。Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。
反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循环45次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。PCR仪为日本大和公司制造的Life express TC-48/H/(t)Thermal Cycler。
取10μl PCR反应产物与2μl上样缓冲液(0.09％溴酚兰，60％甘油，60mM EDTA)混匀，点入含0.5mg/L EB的1.4％琼脂糖凝胶中，在120V下进样15分钟，然后在80V下电泳2小时，取出凝胶，采用Kodak EDAS-120凝胶分析系统进行照相分析。
1.2.2与桔红心连锁的特异SCAR标记的获得1.2.2.1 RAPD产物的回收、克隆和测序用Gene-Clean试剂盒(Bio-Lab公司)纯化回收已证明是连锁的RAPD标记，然后连接到pGEM@-T Vector Easy(Promega公司)载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用RAPD-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致。验证后由上海生工公司完成测序。经电泳验证，扩增片段与目标片段大小一致，片段长度约850bp，经上海生工公司测序后，获得了845bp的序列片段。
1.2.2.2 SCAR引物的设计和PCR反应根据测序结果的两端序列设计引物对，长度16-20个碱基。用SCAR引物进行扩增的反应条件如下25μl的反应体系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1.0μl Primer 1(15ng/μl)，1.0μl Primer 2(15ng/μl)，2.0μl模板DNA(5ng/μl)和0.2μl TaqE(5U/μl)。SCAR-PCR的反应程序为94℃预变性5min，然后94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；再在72℃延伸7min，4℃保存。取10μl反应产物，与2μl溴酚兰(0.25％溴酚兰，40％蔗糖水溶液)混匀，点入含0.5μg/ml EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下稳压电泳约1-2小时，经EB染色后用Kodak EDAS-120凝胶分析仪进行分析照相。
二、结果与分析2.1 DH系群体的球色鉴定收获期对100个双单倍体株系进行了球色鉴定，其中桔红心株系59个，白心株系41个，经卡方测验，x2＝3.24＜x20.05＝3.841，符合1∶1的理论分离，说明桔红心为单基因控制的简单遗传。现暂将桔红心基因定名为Or基因。
2.2随机引物筛选首先对两亲本筛选能产生多态性的RAPD引物，筛选了25套500个Operon系列的10碱基引物(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、S、T、U、V、W、X、Y、Z)，其中462个引物可扩增到清晰的条带，有效引物的比例为92.4％，谱带总数为2032条，平均每个引物扩增的谱带数为4.1条。双亲间有多态性差异的引物124个，经过2次重复，去掉重复性差的引物，得到双亲间稳定表现多态的引物97个。
在59个桔红心DH株系和41个白心DH株系中随机各选8株，分别混合形成桔红心池与白心池，利用有差异的97个引物对两个池的DNA进行扩增，发现13个引物在两池间有差异谱带，但在打开池进行单株确证时，其中12个引物扩增的标记并不与桔红心球色基因连锁或连锁不紧密，见表1。而引物OPB01(5′-GTTTCGCTCC-3′)产生的分子量为845bp的条带OPB01-845在桔红心池的各单株中存在，而在白心池的单株中不存在，重复3次，结果一致(见图1)，初步确定OPB01-845与桔红心球色基因存在连锁关系。
表1 13个引物扩增到的标记在两池中的统计结果
图1 引物OPB01对两亲本、两池及池中各DH单株DNA扩增结果C阴性对照；M分子量标准(100bp DNA ladder)；1P1，91-112；2P2，T12-19；3白心池；4桔红心池；5～12白心池中各单株；13～20桔红心池中各单株2.3连锁距离的测定及连锁关系的进一步验证对100个DH株系DNA用引物OPB01进行PCR扩增，有60株扩增到OPB01-845，40株没有扩增到此带，经卡方检验符合1∶1分离，这一结果与表型检测结果是一致的。59株桔红心单株中仅3株经OPB01扩增未出现OPB01-845，41株白心单株中仅有4株扩增到OPB01-845，即100个DH株系中有7个交换株系，重组率为7％。重复一次，结果一致。根据扩增结果和植株的表型性状测定连锁距离，结果见表2。应用Mapmaker Ver.3.0(Lander ES，Green P，Abrahamson J.MAPMARKERan interactive computer package forconstructing primary genetic linkage maps of experimental and naturalpopulations.Genomics，1987，1174～181.)计算遗传距离为3.8cM(centimorgan)，LOD值为19.05，表明OPB01-845与桔红心基因呈紧密连锁。
表2 OPB01-845标记与桔红心基因(Or)的遗传距离测定结果
为进一步确认OPB01-845与桔红心基因的连锁关系，选取另一群体——桔红心自交系99-63与白心自交系99-2杂交获得的78个F2单株(F3代球色不发生分离)，用引物OPB01进行PCR扩增，其中，42个桔红心植株全部扩增到OPB01-845；36个白心植株中有28株未扩增到OPB01-845，有8株扩增到此条带，此8株为交换株，与田间球色鉴定吻合率为89.7％。这与在DH群体中93％的吻合率基本一致。这一结果进一步证实了OPB01-845与大白菜桔红心基因的紧密连锁关系。
2.4特异片段的测序结果及SCAR引物对设计特异片段OPB01-845的测序结果如下。序列全长为845bp，两端各包含一个OPB01序列(5’-GTTTCGCTCC-3’)。
根据测序结果，两端各延长10个碱基，设计一对20碱基引物SCB01L(5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’)、SCB01R(5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’)。引物由上海生工公司合成。
GTTTCGCTCCCTTCTTCAAATCTTCCGCAATTGACGGCGAATCTGATCTGGGTTCGTCGGAAAAAGCTTCCGCCTTTGGCGAATCGGCGTCTTGGGTTTTCGCGATTTTTCTTTTGTTCGGGGAGGGAGATGAATTGGAAGCTTGGGGGGTCGTTTTCTTCTTGGCGGATGCGCGAGCGTTGGACATGAGAGCGTCGAATGCAGAGGGGCGAGAAGAAGACATTGCTCTGTGGTGGAGGCGCGAGGTGAAGGGAAAGGGGGAAACCAATGCGGAGGAGAATCGAGTTTTAGTGCAGAGAGAAGAAATGCATCGGAAGTGATTCGATGATCGAATCGCTAACATCAGTTTGACTCAGAGAGAGAGAAAGGTAGAGTTTTTTTGAAATTAGGGTTTATGAATTTACGGAGAGGACACGTGTTGCAATCTTGAAGAAAGAAAAATATGGCGGCAGAGTTTCTCCTCTGCTTTGGACGTAGATGATGAGTATATATA
TACAAATTAATTTGAATATTTTGACTTATTAACTCTTTTTATTAACAATTATATATACTAGATCCTCTGTCCGCGCTACGCGCGGATTATAAATTTTAAATATATTATTCATAATTATTATTAATATGTGAATATTTTTACTTTGTATTTAATTTAATTTTAATGTTTAATAGTATCTTTAGCAGTTTTCTATTATTTTTTTTTACGTTTTTGTTTTCTATAAATTTAGAAATTTTGTAAAATTTGGTATATGCACCACTTAGCTTTGGTCTTATGATATGTCTACATTTTATGAACACACTGAAAATGGTGTTGAAATCACGTTATCTTTTATGTCATGGAGGAGCGAAAC实施例2、SCAR引物对在DH群体及F2单株中的PCR分析利用合成的SCAR引物，在58℃的退火温度和35个循环的条件下获得了较好的SCAR扩增结果。这是目前大白菜与桔红心性状连锁的第一个SCAR标记，将其命名为SCB01-845标记。
对DH群体100个株系DNA用SCAR引物对SCB01进行PCR扩增，可以看到扩增到一条长845bp左右的单一条带，在100个DH株系中有60株扩增到OPB01-845，40株没有扩增到此带，这一扩增结果与RAPD标记OPB01-845在DH群体中的分离结果相一致。
结果见图2所示，其中M分子量标准(100bp DNA ladder)；CK阴性对照；W白心池；Or桔红心池；1-32DH株系。
对78个F2单株用SCB01引物对进行PCR扩增，42个桔红心单株全部扩增到SCB01-845，36个白心单株中有29株未扩增到SCB01-845，有8株扩增到此条带，这一PCR扩增结果与RAPD标记OPB01-845在78个F2单株中的分离结果相一致。
用设计合成的SCAR引物对在100个DH株系和78个F2单株进行PCR扩增，扩增结果都表明，SCAR标记SCB01-845与RAPD标记OPB01-845的分离结果相一致，呈共线性分离。这说明RAPD标记OPB01-845已成功的转化为SCAR标记SCB01-845。
在DH群体中SCAR标记SCB01-845与田间球色鉴定的吻合率为93％，在78个F2单株中SCAR标记SCB01-845与田间球色鉴定的吻合率为89.7％，90％的检测准确率说明该SCAR标记可以应用到育种辅助选择中，从而提高球色育种中的选择效率，加快育种进程。
序列表<110>北京市农林科学院<120>与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记及其获得方法<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>845<212>DNA<213>芸薹种芸薹属大白菜亚种(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)<400>1gtttcgctcc cttcttcaaa tcttccgcaa ttgacggcga atctgatctg ggttcgtcgg60aaaaagcttc cgcctttggc gaatcggcgt cttgggtttt cgcgattttt cttttgttcg120gggagggaga tgaattggaa gcttgggggg tcgttttctt cttggcggat gcgcgagcgt180tggacatgag agcgtcgaat gcagaggggc gagaagaaga cattgctctg tggtggaggc240gcgaggtgaa gggaaagggg gaaaccaatg cggaggagaa tcgagtttta gtgcagagag300aagaaatgca tcggaagtga ttcgatgatc gaatcgctaa catcagtttg actcagagag360agagaaaggt agagtttttt tgaaattagg gtttatgaat ttacggagag gacacgtgtt420gcaatcttga agaaagaaaa atatggcggc agagtttctc ctctgctttg gacgtagatg480atgagtatat atatacaaat taatttgaat attttgactt attaactctt tttattaaca540attatatata ctagatcctc tgtccgcgct acgcgcggat tataaatttt aaatatatta600ttcataatta ttattaatat gtgaatattt ttactttgta tttaatttaa ttttaatgtt660taatagtatc tttagcagtt ttctattatt tttttttacg tttttgtttt ctataaattt720agaaattttg taaaatttgg tatatgcacc acttagcttt ggtcttatga tatgtctaca780ttttatgaac acactgaaaa tggtgttgaa atcacgttat cttttatgtc atggaggagc840gaaac 845<210>2
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>与大白菜桔红心性状紧密连锁的SCAR基因上游引物<400>2gtttcgctcc cttcttcaaa20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>与大白菜桔红心性状紧密连锁的SCAR基因下游引物<400>3gtttcgctcc tccatgacat20
权利要求
1.一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增(SCAR)标记，其具有序列表中SEQ ID NO1所述的DNA序列。
2.一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述方法包括如下步骤1)与桔红心连锁的特异随机扩增多态性DNA(RAPD)标记的筛选提取基因组DNA，使用随机扩增多态性DNA标记随机引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过混合分组分析法(Bulked SegregatingAnalysis)，寻找与桔红心性状连锁的随机扩增多态性DNA标记标记，测定连锁距离并验证连锁关系；2)与桔红心连锁的特征序列扩增标记的获得对随机扩增多态性DNA标记产物进行回收、克隆和测序，根据测序结果的两端序列设计引物对，长度20个碱基，用特征序列扩增标记引物进行PCR扩增反应，对反应产物进行电泳分析，测定连锁距离并验证连锁关系。
3.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述步骤1)中的提取基因组DNA是指将1.5克去掉叶柄的叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
4.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述步骤1)中的PCR反应条件是25μl的反应体系中含有2.5μl10×buffer，2.0μl25mM MgCl2，2.0μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng RAPD随机引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循环45次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。
5.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述步骤2)中随机扩增多态性DNA标记产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的随机扩增多态性DNA标记，然后连接到pGEM@-TVector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用RAPD-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。
6.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述步骤2)中的PCR扩增反应的条件是25μl的反应体系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mMdNTP，1.0μl Primer 1，1.0μl Primer 2，2.0μl模板DNA和0.2μl TaqE；SCAR-PCR的反应程序为94℃预变性5min然后94℃变性1min 37℃退火1min 72℃延伸2min 35个循环；再在72℃延伸7min，4℃保存。
7.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述步骤2)中的测定连锁距离并验证连锁关系是指对DH株系DNA用特征序列扩增标记引物进行PCR扩增，根据扩增结果和植株的表型性状测定连锁关系，应用Mapmaker Ver.3.0计算遗传距离。
8.根据权利要求2所述的与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记的获得方法，其特征在于所述特征序列扩增标记引物为5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’和5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’。
全文摘要
本发明公开了一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的特征序列扩增标记，其DNA序列见序列表中SEQ ID NO1序列。其获得方法包括1)提取基因组DNA，使用RAPD随机引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与桔红心性状连锁的RAPD标记，测定连锁距离并验证连锁关系。2)对与桔红心性状连锁的RAPD产物进行回收、克隆和测序，根据测序结果的两端序列设计引物对，长度20个碱基，用SCAR引物进行PCR扩增反应，对反应产物进行电泳分析，测定连锁距离并验证连锁关系。本发明的优点是获得的SCAR标记具有分析程序简单、周期短、所需DNA量极少(一般为5－25ng)且质量要求不苛刻；设备简单；与其他标记类型相比，成本低，重复性好，标记稳定可靠，便于统计。
文档编号C12P19/34GK1594588SQ0315703
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月11日 优先权日2003年9月11日
发明者张凤兰, 张德双, 徐家炳, 刘秀村, 王美, 余阳俊, 赵岫云 申请人:北京市农林科学院