用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用
【专利摘要】本发明公开了用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用。所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第1染色体的第24827153位核苷酸，该核苷酸为A或G。本发明筛选得到桃基因组第1染色体的第24827153作为核苷酸多态性标记位点，能够用于鉴定或辅助鉴定桃果实肉色性状，在鉴定桃果实肉色性状时具有较高的准备率。本发明对15个杂交群体共221份待测桃单株进行SNPs准确率的验证，结果表明，果实肉色SNPs较最近报道的其他研究平均准确率从73.76％提升至86.43％。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。
【专利说明】
用于鉴定桃果实肉色性状的单核昔酸多态性标巧位点、引物、 试剂盒及应用
技术领域
[0001] 本发明设及用于鉴定桃果实肉色（白/黄)性状的单核巧酸多态性标记位点、引物、 试剂盒及应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型， 来进行后续的培育。但在传统育种中，由于很难获知后代的基因型，因此选择的依据通常是 表现型而非基因型，运种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，因为 其表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，因而效率不高。此外，对于W果实性状为目标 的果树来说，运些性状都有其特定的表现时期，通常需要度过3-5年甚至更长时间的童期， 因而选择的时间较晚。运对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的 园艺作物，显然是非常不利的。
[000引近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术，即"分子标记辅助选择" (marker-assisted selection,缩写为MAS)给育种提供了崭新的途径。它通过分析与目的 基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。Bliss (2002)利用包括161个包括同工酶标记、抗病基因类似物标记和SSR(Simple Sequence R邱eats,简单重复序列）标记等构建的图谱，将桃果实肉色标记定位在第1连锁群的31cM 处。由于进行分子标记辅助选择有两个重要的前提，首先是必须得到与目标性状紧密连锁 的标记，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。其次是检测的自动化，由于分子标记辅助 选择要求对育种群体进行大规模检测，因而要求检测的方法要简单、快速、成本低、比较准 确，W实现检测过程(包括DNA的提取、分子标记的检测、数据分析等）的自动化。但是，可W 发现在过去很长一段时间内采用的分子标记，如RFLP(Rest;riction Fragment Length Polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性）、RAPD(random amplified polymo;rphic DM,随机扩增多态性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用电泳检测分型结果，很难 实现运一点。
[0004] SNPs标记（single nucleotide polymo;rphisms，单核巧酸多态性）主要是指在基 因组水平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它在基因组上分布广泛，数量众 多，因此很容易检测到相对于R化？、34?0、4。1^\55財示记更连锁的标记，且在检测时具有高 通量、简单、快速、高灵敏度的优点，是进行分子标记辅助育种中最具潜力的标记。近年来， Falchi(2013)利用一个黄肉的突变体，发现位于Chrl的25639445-25641500bp处的 ppa006109m上存在的转座子序列插入导致了果实肉色的变异。随后，Micheletti等人 (2015)利用数量不超过9000个SNPs的忍片对1580份桃种质进行关联分析，得到了与果实肉 色（白/黄)性状关联的SNPs位于化rl (第1染色体)的26479525bp处。
[0005] 然而，现有的与桃果实肉色（白/黄)性状连锁的SS財示记距离目标基因定位距离较 远，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低;而现有的与目标性状连锁的SNPs标记多来自忍 片鉴定的结果，由于忍片位点较少（少于9000个），因此不能保证鉴定出的SNPs是与目标性 状最关联或连锁的位点。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供用于鉴定桃果实肉色性状的单核巧酸多 态性标记位点、引物、试剂盒及应用，该标记位点在鉴定桃果实肉色性状时具有较高的准确 率。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 用于鉴定桃果实肉色性状的单核巧酸多态性标记位点，所述的单核巧酸多态性标 记位点是桃基因组第1染色体的第24827153位核巧酸，该核巧酸为A或G。
[0009] 用于鉴定桃果实肉色性状的PCR扩增引物对，所述引物对中的上游引物是根据桃 基因组第1染色体的第24827153位核巧酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引 物是根据第1染色体的第24827153位核巧酸的下游序列进行设计。
[0010] 所述引物对由如沈Q ID NO.2和沈Q ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
[0011] 用于鉴定桃果实肉色性状的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物为如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和沈Q ID NO.6所示的核巧酸序列。
[0012] 用于鉴定桃果实肉色性状的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的PCR扩增引物对和 所述的单碱基延伸引物。
[0013] 桃基因组第1染色体的第24827153位核巧酸的单核巧酸多态性在鉴定或辅助鉴定 桃果实肉色性状中的应用。
[0014] -种单核巧酸多态性标记位点在桃果实肉色性状分子标记辅助选择育种方面的 应用。
[0015] 所述的单核巧酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃果实肉色是白色性状或是 黄色性状中的应用。
[0016] -种试剂盒在桃果实肉色性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
[0017] -种利用单核巧酸多态性标记位点鉴定桃果实肉色性状的方法，包括W下步骤： [001引（l)PCR扩增：W待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物；
[0019] (2)SAP反应:配制SAP反应体系，加入步骤（1 )PCR扩增反应后的反应体系中，除去 PCR扩增反应中未反应的dNTP;
[0020] (3)单碱基延伸反应:配制单碱基延伸反应体系，加入步骤(2)SAP反应后的反应体 系中；
[0021 ] (4)基因分型：将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在忍片上，由 忍片扫描仪扫描，检测分析，根据不同产物的分子量大小进行基因分型。
[0022] 本发明筛选得到桃基因组第1染色体的第24827153位核巧酸多态性标记位点，能 够用于鉴定或辅助鉴定桃果实肉色（白/黄)性状，在鉴定桃果实肉色（白/黄)性状时具有较 高的准确率。
[0023] 本发明针对桃基因组第1染色体的第24827153位核巧酸多态性的特性，设计了特 定的PCR引物扩增对和单碱基延伸引物，将完成单碱基延伸反应的的产物进行树脂脱盐处 理，点在忍片上，由忍片扫描仪扫描，进行MALDI-TOF质谱检测，Typer4.0软件分析实验数 据，根据不同产物的分子量大小获得其基因分型结果。
[0024] 本发明对15个杂交群体共221份待测桃单株进行SNPs准确率的验证，结果表明，本 发明对肉色性状的平均准确率从73.76%提升至86.43%。运说明，利用本发明的单核巧酸 标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。
【具体实施方式】
[0025] W下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0026] 实施例1 SNPs标记位点的获得
[0027] 本发明W从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃随机获得的129份桃种 质为样品，采用常规CTAB法提取样品DNA，并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对129份桃种 质进行重测序，得到121加数据，平均覆盖桃基因组89.28%，平均测序深度为4.21 X左右。 根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组V. 1.0(http : //www. rosaceae . org/ node/355)进行比对，鉴定出4063377个SNPs,利用运些SNPs对129份种质的表型性状进行全 基因组关联分析，鉴定出与桃果实肉色的有显著关联的SNPs位于第1染色体的第 24827153bp 处。
[0028] 实施例2利用SNP标记鉴定桃果实肉色（白/黄)性状的方法 [00巧]1、DNA提取
[0030] 采用常规CTAB法提取待测桃样品组织的DNA，去除RNA，DNA样品总体积不低于15ii 1。用紫外光光度计测定DNA样品在26化m、280皿处的0D值，计算DNA含量和OD260/28日的比值。 DNA样品纯度0〇26日/28日值应在1.8-2.0之间，浓度稀释至1 Ong/山。
[0031] 2、设计引物
[0032] 根据桃基因组第1染色体的第24827153位处左右各2(K)bp序列（具体的核巧酸序列 见表1)，设计引物。
[0033] 亲1 SNPs妾侧序列信息
[0034]
[0035] 其中，R表示A或G。
[0036] 引物由生物技术公司合成后，稀释PCR扩增上下游引物至终浓度均为0.5咖。稀释 单碱基延伸引物至延伸引物1、2、3终浓度分别为祉M、10咖、15咖，备用。引物序列见表2。
[0037] 表2引物序列
[00；3 引
[0039] 3、PCR反应体系及Mass ARRAY分析
[0040] 按照SEQUEN0M-巧LEX标准操作流程进行PCR、SAP、单碱基延伸反应，主要步骤如 下：
[0041 ] (l)PCR扩增反应
[0042] 首先，配制PCR扩增体系，具体见表3。
[0043] 表3 Sequenom MassArray系统基因分型扩增PCR反应组分
[0044]
[0045]
[0046] 其中，Primer Mix为PCR扩增上游引物和下游引物各加入0.化1。
[0047] 将上述试剂转移到PCR管或板中，
[004引 PCR扩增程序如下：94°C 15min; 94°C 20s，56 °C30s，72°C Imin，共45个循环；72°C 3min;4°C 保存。
[0049]配置1%琼脂糖凝胶，对PCR反应后的产物进行电泳，如果条带明亮且单一，则进行 后续试验。
[(X)加](2)SAP(邮碱性憐酸酶)反应
[0051] 利用该反应除去未用尽的dNTP，首先配制反应体系，见表4:
[0052] 表4 SAP酶促反应相关试剂配制组分
[0化3]
[0054] 将配好的上述溶液化1加入到完成PCR反应的PCR管或板中。按如下程序进行SAP反 应。
[0055] SAP 反应程序：37 °C 40min; 85 °C 5min; 4°C 保存。
[0化6] (3)单碱基延伸反应
[0057]首先配制单碱基延伸反应体系，见表5:
[005引表5延伸反应相关试剂组分
[0化9]
[0060] 其中，iPLEX Extend Primer Mix为单碱基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3 的加入浓度分别为祉M、10咖、15咖，单碱基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.9化1。
[0061] 然后将配好的溶液化1加入到SAP反应后的PCR管或板中，进行延伸反应，程序如 下：94°C 30s; 94°C 5s，（ 52 °C 5s，80 °C 5s，5个循环），共40个循环；72 °C 3min; 4°C保存。
[0062] 将完成延伸反应的的产物进行树脂脱盐处理，点在忍片上，由忍片扫描仪扫描，进 行MALDI-T0F质谱检测，Typer4.0软件分析实验数据，根据不同产物的分子量大小获得其基 因分型结果。当完成延伸反应的产物分子量为6853.5左右时，化rl: 24，827，153bp处为纯合 位点，分型为A/A，对应种质的表型为果肉呈黄色。分子量为6869.5左右时，Chrl: 24，827， 153bp处为纯合位点，分型应为G/G;分子量约为6861.5时，Chrl: 24，827，153bp处为杂合位 点，分型为A/G;G/G和A/G运两种分型对应的种质表型为果肉呈白色。
[0063] 实施例3 15个杂交群体利用果实肉色关联SNP标记进行表型性状的盲测验证
[0064] 1、实验材料的选择
[0065] W郑州果树研究所资源圃中种植的常规桃品种为实验材料，从中选取调查过表型 性状的15个杂交群体共221份单株，具体见表6。
[0066] 表6供试杂交群体的名称及群体大小信息
[0067]
[006引
[0069] 2、利用果实肉色关联SNP标记的鉴定方法
[0070] W本发明桃基因组第1染色体的第24827153位作为核巧酸多态性标记位点，对15 个杂交群体共221份桃单株果实肉色进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2的方法。 同时，W现有的国外报道的桃基因 SNPs位点作为对照，与本发明的SNPs位点进行比较分析。
[0071] 3、杂交群体中分型结果对表型的预测能力比较
[0072] 从鉴定结果可W看出，与目前国外报道的利用约9千个SNPs进行关联分析得到的 最连锁SNPs(化rl: 2647952加 P)相比，本发明SNPs位点的卡方测验P值最低，即显著性最高 (表 7)。
[0073] 表7不同果实肉色关联或连锁SNPs在15个杂交群体的分型结果及卡方测验
[0074]
[0075] 综合比较，其准确率如表8所示，可W看出本发明在进行杂交群体的表型性状预测 时，准确率有明显提升，果实肉色SNPs较最近报道的其他研究平均准确率从73.76%提升至 86.43%。
[0076] 表8本发明设及的SNPs在对15个杂交群体鉴定后的表型预测能力(准确率)比较
[0077]
[0078] 综上所述，本发明的SNPs位点能够帮助实现利用桃幼苗DNA早期预测桃成龄后果 实肉色性状的目的，该方法是利用重测序得到的400万W上SNPs中全基因组关联分析得到 最关联的位点从而实现的，由于原始SNPs数量庞大，从而保证了得到的关联标记关联性高。
【主权项】
1. 用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点，其特征在于，所述的单核苷 酸多态性标记位点是桃基因组第1染色体的第24827153位核苷酸，该核苷酸为A或G。2. 用于鉴定桃果实肉色性状的PCR扩增引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物 是根据桃基因组第1染色体的第24827153位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中 的下游引物是根据第1染色体的第24827153位核苷酸的下游序列进行设计。3. 根据权利要求1所述的用于鉴定桃果实肉色性状的PCR扩增引物对，其特征在于，所 述引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。4. 用于鉴定桃果实肉色性状的单碱基延伸引物，其特征在于，所述单碱基延伸引物为 如SEQIDN0.4、SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示的核苷酸序列。5. 用于鉴定桃果实肉色性状的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2或3 所述的PCR扩增引物对和权利要求4所述的单碱基延伸引物。6. 桃基因组第1染色体的第24827153位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定桃 果实肉色性状中的应用。7. -种权利要求1所述的单核苷酸多态性标记位点在桃果实肉色性状分子标记辅助选 择育种方面的应用。8. 根据权利要求7所述的单核苷酸多态性标记位点在桃果实肉色性状分子标记辅助选 择育种方面的应用，其特征在于，所述的单核苷酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃果 实肉色是白色性状或是黄色性状中的应用。9. 一种权利要求5所述的试剂盒在桃果实肉色性状分子标记辅助选择育种方面的应 用。10. -种利用权利要求1所述的单核苷酸多态性标记位点鉴定桃果实肉色性状的方法， 其特征在于，包括以下步骤： (1 )PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得PCR扩 增产物； (2) SAP反应:配制SAP反应体系，加入步骤(1 )PCR扩增反应后的反应体系中； (3) 单碱基延伸反应：配制单碱基延伸反应体系，加入步骤（2)SAP反应后的反应体系 中； (4) 基因分型：将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片 扫描仪扫描，检测分析，根据不同产物的分子量大小进行基因分型。
【文档编号】C12Q1/68GK106048042SQ201610539560
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月9日
【发明人】王力荣, 曹珂, 朱更瑞, 方伟超, 陈昌文, 王新卫, 王琪
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所