一种耗牛foxo1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及一种耗牛F0X01基因单核苷酸多 态性的检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] F0X01是F0X0家族的成员之一，作为转录因子，其通过翻译后修饰等方式调节下游 靶基因转录，参与氧化应激、凋亡、DNA损伤修复、细胞周期阻滞等生物学过程，。目前F0X01 基因作用机制尚未完全阐明，针对F0X01基因研究已成为当今研究热点。对F0X01基因进行 定性分析有助于对F0X01基因的进一步研究。
[0003] 单核苷酸多态性(SNP)是基因组中发生频率最高的变异种类。研究SNP可促进人们 对基因组结构、基因的进化历史及疾病发生根源的了解。SNP是种群遗传分析、疾病发生机 理和药物研发等领域的重要研究对象。目前，针对SNP研究所建立的数据库和高效、精确、方 便操作的工具，对于展现SNP在引领遗传分析、疾病诊治等领域发展方面的重要性具有很高 的利用价值。
[0004] 单核苷酸多态性（singlenucl eoti depolymorph ism，SNP)是指相同或不同物种个 体的基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。其中多态性 (polymorphism)指的是形态多样性和状态多样性，在这里是基因水平上的多态性，指一个 基因座位上存在多个等位基因，它是基因组中发生频率最高的点突变，在已知DNA的多态性 中占了大约90 %。同时，也发现每1000个碱基中就有一个会发生变异，它在一个种群中的发 生率至少在1 %水平。因此，具体地说，SNP指的是基因组序列中单核苷酸(A、T、C和G)改变时 所发生的DNA序列的多态性变化，即基因组内特定的核苷酸位置上存在2种或更多不同的碱 基，其中最少一种在群体中的频率不低于1 %。
[0005] 多态性(SNP)位点的经典方法是一大类以凝胶电泳为基础的一系列传统方法，包 括:限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，此方法应用的前提是SNP位点必须含有限制性内 切酶的识别位点，但此方法是SNP位点筛查中最经典的方法之一;单链构象多态性法(PCR-SSCP)，该方法简单快速，被广泛运用与未知基因突变的检测，但这种方法对温度要求严格 且不能确定突变的类型及突变的具体位置，因而带有一定的盲目性。变性梯度凝胶电泳 (DGGE)，多用于分析自然环境中细菌类和、真核生物和病毒等生物的多样性。此方法具有可 重复和操作简单等特点，但此法会受到DNA分子互补链中氢键的含量的影响，因此很少用于 SNP位点的检测分析;等位基因特异性PCR法(ASPCR)。
[0006] 而现有的一些新型SNPs高通量检测方法包括:高效液相色谱法(DHPLC)法;基因芯 片法及DNA直接测序法。其中DHPLC法检测效率高便于自动化的优点，且准确率高，但DHPLC 对所用试剂和环境要求高，易产生误差。基因芯片法具有信息量大、自动化程度高的特点， 但芯片造价成本昂贵，所需设备贵重，所以不利于普及应用。而DNA直接测序法突变位点检 出率高、速度快，摆脱了传统的凝胶电泳所对温度的要求，且对其类型和位置分析准确，带 有目的性，成本相对低，利于广泛应用于检测SNP位点。
[0007] 目前现有技术中针对F0X01基因遗传变异的研究较少，该基因位点的功能研究及 其遗传变异与经济性状关联的研究仍是空白，且现有针对F0X01基因单核苷酸多态性的检 测多存在探针与目标序列存在错配碱基的问题，这样，就会大大减少探针与目标序列结合 的紧密度，影响探针的荧光释放量，导致检测结果不准确。由此可见能否提供一种耗牛 F0X01基因单核苷酸多态性的检测方法，有效实现耗牛F0X01基因单核苷酸多态性的检测， 且具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，成为本领域技术人员亟待解 决的技术问题。
【发明内容】
[0008] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种耗牛F0X01基因单核苷酸多态性的检测 方法及其试剂盒，该方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点。
[0009] 为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：
[0010] 一种耗牛F0X01基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
[0011]步骤一：制备牦牛F0X01基因扩增产物：首先提取耗牛血液基因组DNA，将其稀释 后，以基因组DNA为模版，以牦牛F0X01基因序列设计特异性引物对A和特异性引物对B，进行 PCR扩增耗牛F0X01基因，得到PCR扩增产物后纯化;取纯化后PCR扩增产物测序，找出单核苷 酸位点；
[0012]步骤二:合成高低温内标:通过高分辨率熔解曲线分析耗牛F0X01基因单核苷酸多 态位点的DNA探针，进行基因型分析，合成高低温内标，并对恪解曲线进行校正；
[0013] 步骤三：制备HRM-PCR扩增产物：取F0X01基因的基因组DNA，加入步骤二所述的耗 牛F0X01基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行HRM-PCR扩增，得到HRM-PCR扩增产物；
[0014]步骤四：收集荧光信号:将步骤二合成的高低温内标稀释，并与步骤三制备的HRM-PCR扩增产物混合，于高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号，通过不同的荧光检测结 果确定检测SNP位点处碱基突变的基因型。
[0015]进一步的，所述特异性引物对A为：
[0016] 上游引物:5' AGAGGGAGGCAAGAGTGG 3';
[0017] 下游引物：5' ATGTCGTTGTGCGGAGGA 3';
[0018] 所述特异性引物对B为：
[0019] 上游引物:5' ATCCAGAGGGAGGCAAGA 3';
[0020] 下游引物:5' GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA 3'。
[0021 ]进一步的，所述特异性引物对A扩增长度为702bp，其PCR扩增位置为165-866,所述 特异性引物对B扩增长度为371bp，其PCR扩增位置为161-531。
[0022] 进一步的，所述PCR扩增的反应程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，复性30s， 特异性引物对A扩增退火温度为61°C，特异性引物对B扩增退火温度为62°C，72°C延伸30s， 35个循环，72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0023]进一步的，所述步骤二中的耗牛F0X01基因单核苷酸多态位点的DNA探针核苷酸序 列为：针对F0X01基因720C/T位点的上游探针：5' CCCTGCTACTCCTTTGC 3';针对F0X01基因 720C/T位点的下游探针:5' CATGCCTCCATAACTCG 3'。
[0024] 进一步的，所述步骤三的HRM-PCR扩增的反应程序为：95°C预变性5min，94°C变性 20s，复性20s退火温度55°C，72°C延伸20s，35个循环，72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0025] 进一步的，所述步骤四中的高低温内标稀释的方法包括以下步骤:10D内标单链加 400yL双蒸水，退火体系为：饱和氯化钠 lyL内标互补双链各lyL，补水至10yL，95°C水浴 3min，温度降至室温，得到稀释后的高低温内标。
[0026] 进一步的，所述高低温内标的核苷酸序列为：
[0027]退火温度为57°C的低温I内标：
[0028] 57 GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-37 ；
[0029]退火温度为53°C的低温II内标：
[0030] 57 TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTAATATATAAATATAATAC-C3-37 ；
[0031 ]退火温度为86°C的高温I内标：
[0032] 5'GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3 7 ；
[0033] 退火温度为86°C的高温II内标：